基于LAMP技术的河鲀及其制品快速鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种生物检测领域，尤其涉及基于LAMP技术的河鲀及其制品快速鉴定方法及该方法使用的引物对和试剂盒。本发明专利技术基于COI序列和D

【技术实现步骤摘要】
基于LAMP技术的河鲀及其制品快速鉴定方法


[0001]本专利技术涉及一种生物检测领域，尤其涉及基于LAMP技术的河鲀及其制品快速鉴定方法寄 该方法使用的引物对和试剂盒。

技术介绍

[0002]河鲀鱼(Pufferfish)作为我国等亚洲沿海地区的传统美食，具有非常高的营养价值和经 济价值。但野生河鲀含有剧毒，食用不当可造成严重的中毒甚至死亡。市场上存在河鲀鱼冒 充其他水产品出售的现象，严重损害消费者的生命健康。仅凭形态学方法很难对河鲀制品进 行鉴别，因此急需建立河鲀物种及其制品的快速、准确的分子鉴定方法。
[0003]食品鉴定主要有传统形态学方法、理化分析以及分子生物学方法。经过深加工的食品， 完全不具备活体状态下的形态后，形态学鉴定的方法完全不能使用。食品的理化分析是指借 助测量工具或仪器，针对蛋白质和脂肪等性质进行分析，常见方法有酶联免疫吸附分析 (ELISA)、免疫荧光技术(IFT)和高效液相色等方法。但是这些方法往往需要较为新鲜的样品， 一旦食品变质，就会对鉴定结果产生影响。此外，近些年新兴的无损检测技术也受到越来越 多的关注。该技术可以利用光学、电磁学和声学的技术，对食品的表面或内部的结构和性质 进行检测。例如：X射线法、太赫兹技术和红外光谱法。这些方法虽然快速、无损、信息量 大，但是其仪器的维护成本和模型的建立与改进需要的后期成本和技术门槛太高。
[0004]为此，申请人申请的中国专利技术专利申请(CN108950007A，公开号：20181207)以4种我 国东部沿海地区常见的河鲀为研究对象，即河鲀有黄鳍东方鲀(Takifugu xanthopterus)、 暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)、菊黄东方鲀(Takifuguflavidus)和红鳍东方鲀 (Takifugu rubripes)，筛选构建适合的DNA条形码COI序列，并在此基础上，设计2对HRM 引物，提供一种基于COI序列的河鲀及其他鱼肉制品的HRM快速鉴定方法。
[0005]环介导等温扩增技术(loop
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mediated isothermal amplification,LAMP)由Notomi等 于2000年提出，是一种新型的核酸等温扩增技术，即在恒温条件下利用一种具有链置换功能 的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)进行核酸的快速扩增。其引物设计主要针对目的片段 5
’
端和3
’
端的6个区域设计2对特异性引物，包括1对内引物(FIP、BIP)、1对外引物 (F3、B3)。在60～65℃的恒定温度下，内引物识别相应的位点并延伸，同时外引物在Bst DNApolymerase的作用下将内引物形成的链置换出来，形成一个哑铃状结构的DNA片段，为后续 反应提供模板。之后内引物对其进行识别、延伸，最终形成一系列茎环结构和多环花椰菜结 构的DNA片段混合物。
[0006]在动物源食品方面，特别是在禽畜肉等食品中，已经有大量研究证实LAMP技术是切实可 行的。Wang等(WANG J,WAN Y,CHEN G,et al.Colorimetric Detection of Horse MeatBased on Loop
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Mediated Isothermal Amplification(LAMP)[J].Food Analytical Methods, 2019,12(11):2535
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2541.)以COI基因为目标建立基于HNB及neutral red(中性红)染 料的马肉成分LAMP比色检测方法，可在1h内检测牛肉中的马肉成分，检出限达6pg，
并 且通过使用市场销售的DNA直接提取液，可将现场检测控制在2h。Zhang等(ZHANG C,ZHANGX,LIAO G,et al.Species
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specific TM
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LAMP and Trident
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like lateral flow biosensorfor on
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site authenticity detection of horse and donkey meat[J].Sensors and ActuatorsB
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Chemical,2019,301:127039.)基于TM
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LAMP(tag
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labeled multiplex loop
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mediatedisothermal amplification)和LFB(lateral flow biosensor)建立了马肉和驴肉的现场检 测方法，检测限低至40pg，可在40min完成现场检测。谭贵良等针对猪牛、鸡、鸭的Cytb 基因分别设计了特异性LAMP引物，建立了食用植物油和餐厨废弃油中动物源成分的LAMP检 测方法，可分别检测出动物油脂与餐厨废弃油中含量为1％和5％的动物源成分。Girish等 (Girish P S,Barbuddhe S B,Kumari A,et al.Rapid detection of pork using alkalinelysis
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Loop Mediated Isothermal Amplification(AL
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LAMP)technique[J].Food Control, 2020,110:107015.)基于D
‑
loop序列建立了猪肉成分的LAMP检测方法，灵敏度为0.5ng/μL， 可检测出混合样品中0.1％的猪肉成分，通过碱裂解法快速提取DNA，结合LAMP检测，将检测 时间缩短在120min，即便是经高温处理的样品也依然适用。冼钰茵等(冼钰茵,易敏英,张 璜等.环介导等温扩增技术快速检测肉及肉制品中的牛源性成分[J].食品工业科技,2016, 37(7):278
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282.)以牛源性线粒体Cytb基因为模板，建立了肉及肉制品中牛源性成分的LAMP 检测方法，对市场上12种牛肉及牛肉制品进行检测，结果显示检测限为0.1％。而在水产品 方面，有关于LAMP技术的应用还较少。Saull等(Saull J,Duggan C,Hobbs G,et al.Thedetection of Atlantic cod(Gadus morhua)using loop mediated isothermal amplificationin conjunction with a simplified DNA extraction process[J].Food Control,2016,59: 306
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313.)开发了大西洋鳕鱼的LAMP快速鉴定方法，结合简单的DNA前处理，大大缩短了样 品的检测时间。并且灵敏度高，能检测到混合样品中0.1％的鳕鱼成分。Spielmann等 (Spielmann G,Ziegler S,Haszp本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于LAMP技术的河鲀及其制品快速鉴定方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1)河鲀鱼样品的DNA提取使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒进行，制备好的基因组溶液置于
‑
20℃保存；2)基于COI序列设计1组针对东方鲀属物种的引物；或者，基于D
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loop序列设计了1组针对暗纹东方鲀的引物；基于COI序列的引物序列如下：基于D
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loop序列的引物序列如下：3)LAMP反应采用20μL的反应体系，具体成分如下：
4)开始反应前，在反应液面上加入20μL石蜡油；反应条件为：65℃反应60min，80℃灭活10min；5)LAMP反应产物的检测采用两种方式之一：
①
电泳检测；用1
×
TAE缓冲液配置浓度为2％的琼脂糖凝胶，取10μL反应产物与2μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁艳菲，朱诚，陈成统，吕晨泽，张雷蕾，黄丽红，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：