用于检测牛无角基因的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及基因突变检测技术领域，具体涉及用于检测牛无角基因的引物组、试剂盒及方法。所述引物组包括如SEQ ID NO.1～9所示的引物，更优选所述引物组中还包括SEQ ID NO.10～12所示的引物。本发明专利技术能同时检测牛Celtic无角基因、Mongolian无角基因和Friesian无角基因，可以快速、准确、批量地实现对牛无角性状的表型和/或基因型的检测。将本发明专利技术应用于牛无角性状的分子育种中时，可以选择无角基因纯合子，以高效提升后代牛群的无角基因频率。以高效提升后代牛群的无角基因频率。

【技术实现步骤摘要】
用于检测牛无角基因的引物组、试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及基因突变检测
，具体涉及用于检测牛无角基因的引物组、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]在自然界中，牛角是抵御天敌、争夺配偶的工具，而在集约规模化养殖条件下，角的存在不仅会给动物间带来互相伤害，也给饲养人员带来安全威胁。目前规模化牛场通常对出生一周内的犊牛进行去角，然而其缺点在于给牛带来了应激反应，影响了动物生长及动物福利，同时耗费人力、物力、财力。天生无角是牛生产中的有利性状，开发牛无角基因检测方法，可用于牛无角性状的分子育种。例如，在选择种牛时，鉴定和选择无角基因纯合子，可以快速提升后代牛群的无角基因频率。
[0003]牛的无角性状遗传方式为常染色体显性遗传，具有多等位基因的特点，目前已知有三类不同来源的无角基因，均位于牛的1号染色体上(参考基因组：Bos_taurus_UMD_3.1)。第一种称为Celtic等位基因(Medugorac et al.2012)，存在于以安格斯牛、弗莱维赫牛、西门塔尔牛等肉牛及乳肉兼用牛品种中，属于插入缺失类突变(InDel)，即在1号染色体上1,705,834-1,706,045bp处存在一段212bp的重复，该重复代替了一段位于1,706,051-1,706,060bp长度为10bp的序列，该位点表示为P
202ID
。第二种称为Mongolian等位基因(Medugorac et al.2017)，发现于蒙古牛中，该突变有两个特异性突变位点，一是在1,975,461
–
1,975,487bp处存在1bp的插入缺失，表示为P
1ID
；二是在1,976,128bp处存在一个219bp的插入，表示为P
219ID
。第三种称为Friesian等位基因(Medugorac et al.2012)，主要存在于以荷斯坦牛、娟姗牛为代表的奶牛品种中。该等位基因存在5个紧密连锁的候选突变位点，其中3个是单核苷酸多态(SNP)，分别为：1,654,405bp处G
→
A(P
G1654405A
)；1,655,463bp处C
→
T(P
C1655463T
)；1,768,587bp处C
→
A(P
C1768587A
)。另外2个为插入缺失(InDel)，即在1,649,163
–
1,649,169bp处有一段5bp的InDel(P
5ID
)、在1,909,352-1,989,480bp后存在一段长度为80,128bp的串联重复(P
80kbID
)，该串联重复内部还存在一个SNP(1,909,354:T
→
A)和一个2bp的缺失(1,909,396D2:TG)。
[0004]目前已有研究报道了这3类牛无角基因的检测技术。检测Celtic无角基因可以通过PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳(Medugorac et al.2012)或PCR扩增产物片段长度分析(毛细管电泳)(Wiedemar et al.2014)。检测Mongolian无角基因也是通过PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳(Medugorac et al.2017)。针对复杂的Friesian无角基因，Medugorac et al.(2012)报道了5个紧密连锁突变位点的检测方法，即利用商业化的试剂盒(KASPar,KBioscience)检测P
G1654405A
和P
C1655463T
；利用限制性片段长度PCR(PCR-RFLP)检测P
C1768587A
；利用PCR扩增产物片段长度分析检测P
5ID
；对于复杂的80kb重复片段(P
80kbID
)，针对其内部的2bp缺失通过PCR扩增产物片段长度分析来分型。Wiedemar et al.(2014)则报道通过PCR扩增产物直接Sanger测序方法，对Friesian无角基因相关联的SNP及P
5ID
进行分型，而对P
80kbID
则设计重复片段特异性引物，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，通过观察产物条带的有无来
判断是否携带无角基因。
[0005]总结现有的检测方法，存在以下问题：1、没有统一的检测技术能够同时对三种无角等位基因进行检测；2、现有基于Sanger测序技术的检测方法，操作步骤多、耗时长，无法实现快速检测；3、针对Friesian无角基因，已报道的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测，只能判断是否携带无角基因，无法区分无角等位基因的杂合子和纯合子，未达到精确分型的效果。
[0006]KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)是近年来新出现的一种DNA变异分型技术，基于竞争性等位基因特异性PCR原理，具有准确、灵活、成本低的特点，对SNP、Indel及大片段缺失插入等不同变异类型均可检测。本专利技术基于KASP原理，优化设计特异性的引物组合，开发了同时检测牛3种无角基因的新方法，显著提高了牛无角基因检测的效率。

技术实现思路

[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于快速检测牛无角基因的引物组、试剂盒及方法。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术选取了3种无角基因的特异性位点，包括Celtic无角基因位点P
202ID
，Mongolian无角基因位点P
1ID
，Friesian无角基因的中涉及以下两个位点——P
C1768587A
和P
80kbID
。本专利技术发现，利用P
80kbID
鉴别是否携带Friesian无角等位基因，同时利用P
C1768587A
位点辅助判定其为无角基因的纯合子或杂合子，可以精准地实现对Friesian无角基因的检测。
[0009]针对上述4个位点，分别优化设计特异性的引物组合(见图1，下表1)，每个引物组合包含3条引物，包括上游引物2条和下游引物1条，其中2条上游引物是根据位点等位基因序列差异而设计的，在KASP扩增过程中分别加上不同的荧光基团(FAM和HEX)，最后根据PCR产物荧光信号进行基因型分型。利用这些引物组合能够实现采用相同的技术平台，对3种无角基因同时检测，从而根据这些分子标记位点基因型可以实现牛无角性状的快速、准确、批量检测。
[0010]表1引物序列
[0011][0012][0013]根据上述发现，本专利技术首先提供了一种用于检测牛无角基因的引物组，包括：
[0014]引物组I：上游引物：
[0015]5’-
GATAGTTTTCTTGGTAGGCTGGTATTCTT-3
’
(SEQ ID NO.1)，
[0016]5’-
GTGAGATAGTTTTCTTT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测牛无角基因的引物组，其特征在于，包括：引物组I：上游引物：5
’-
GATAGTTTTCTTGGTAGGCTGGTATTCTT-3
’
，5
’-
GTGAGATAGTTTTCTTTGCTCTTTAGATCA-3
’
；下游引物：5
’-
TTGGGATAGACTTAAAAATGAAAAGAGAGT-3
’
；引物组II：上游引物：5
’-
TGTCAAGTGTCTCTGTCAAGAGATTCAG-3
’
，5
’-
CTGTCAAGTGTCTCTGTCAAGATTCAGA-3
’
；下游引物：5
’-
CCTGCCATGATAAAGATGTTGGCT-3
’
；引物组III：上游引物：5
’-
CCCCTCCCCTGTGTGTG-3
’
，5
’-
CCCTCCCCTGTGTGCA-3
’
；下游引物：5
’-
GGAAGAAACCTACATGAGTGAGTG-3
’
。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，还包括：引物组IV：上游引物：5
’-
CCAGTTTTATCTTTTTCCCCTCCAC-3
’
；5
’-
CCAGTTTTATCTTTTTCCCCTCCAA-3
’
；下游引物：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毅，颜泽，王雅春，张胜利，肖炜，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：