一种海蛇毒特异性检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了微量海蛇毒特异性检测方法和试剂盒，属于生物技术领域。本发明专利技术通过提取毒素中微量基因，分别使用不同引物对作为特异性引物，经PCR扩增获得产物，通过琼脂糖凝胶电泳和测序后验证为海蛇特异性基因序列。本发明专利技术的检测方法和试剂盒具有特异性高，稳定性好，检测迅速，易于操作等优点，有利于规模化和自动化检测分析，是快速、特异的鉴别海蛇及其毒素的一种方法。素的一种方法。素的一种方法。

【技术实现步骤摘要】
一种海蛇毒特异性检测方法和试剂盒


[0001]本专利技术属生物
，涉及国内常见毒蛇中海蛇毒的检测方法和检测试剂盒；尤其涉及一种海蛇毒特异性检测方法和检测试剂盒。

技术介绍

[0002]据《中国蛇类图谱》记载，我国沿海栖居着9属16种海蛇，是主要的海洋有毒生物。海蛇和眼镜蛇有密切的亲缘关系，均为剧毒蛇。海蛇的毒液属于最强的动物毒。海蛇广泛分布于南海、北部湾、海南、台湾、广西、广东和东海沿海的暖水海域。我国东南沿海地区是我国海洋产业开发的重点地区，近年来随着对海洋资源开发利用的不断增多，海上作业人员及海边度假游客遭受海洋生物伤的情况也时有发生。同时东南沿海海域具有极其重要的军事战略意义，所有海上军事行动比如海上军事演习、渡海登陆作战以及和平时期的岛屿防御等都要面临海洋生物伤的危险。文献资料与调研结果表明，海蛇咬伤是最严重的海洋生物伤,近年来其发病率呈不断上升的趋势。
[0003]我国东南沿海地区每年被海蛇咬伤或咬死的人数也不少, 广西每年均有被海蛇咬伤致死的病例记录，这种咬伤病例往往是海蛇排毒量大，患者中毒较明显。根据世卫组织被忽视的热带病问题战略技术咨询小组第十次会议的建议，世卫组织已把毒蛇咬伤列为需要高度重视的被忽视热带病。
[0004]我国海域分布的海蛇包括长吻海蛇，平颏海蛇，青环海蛇等。海蛇毒对小鼠的半数致死剂量LD50在0.044-0.24mg/kg之间。相同干重的海蛇毒致死毒性远高于眼镜蛇。
[0005]注射抗毒血清是目前世界范围内公认的对毒蛇咬伤最有效的急救措施，国外已有少数国家研制成抗海蛇毒血清产品，有的己应用于临床救治工作，海蛇咬伤目前国内尚无特效药物，患者往往都被送入当地的小医院，各级医疗单位依各自经验进行对症治疗，没有形成规范化的急救方案，效果欠佳。但是由于毒蛇种类繁多，非专业人士通常难以鉴别。毒蛇咬伤患者的治疗需要正确鉴别肇事毒蛇种类，方能正确选择适当的抗蛇毒血清，提高毒素拮抗效率获得理想的疗效，同时减少注射不匹配的抗蛇毒血清的几率，从而降低血清病等严重过敏反应发生的风险，错失治疗时机。然而目前我国蛇伤临床诊断主要依靠病人口述病史和临床表现，可能造成治疗的盲目性，由于缺乏快速、特异的实验室鉴别蛇毒种类的方法，难以针对性的进行治疗。此前海蛇的全基因组序列尚未公布，未见从样品尤其蛇毒中提取DNA 并扩增出靶标序列的特异性引物和方法。因此，本专利技术基于现代分子生物学技术，利用已有的研究基础，开发一种操作简单，鉴别准确，迅速高效，灵敏度高，特异性好的检测方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题之一在于提供一种海蛇毒特异性检测方法，该方法利用PCR技术使用特异性的引物扩增目的基因来鉴别海蛇及海蛇毒，本方法可以检测出来自样品的微量DNA，具有检测灵敏度高，方法快速，易操作的优点。
[0007]本专利技术要解决的技术问题之二在于提供一种快速检测海蛇及其毒素的特异性引物对。
[0008]本专利技术要解决的技术问题之三在于提供上述特异性引物对或其互补序列在制备鉴别海蛇毒的产品中的应用。
[0009]本专利技术要解决的技术问题之四在于提供检测海蛇毒的PCR检测试剂盒。
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：在本专利技术的第一方面，提供一种海蛇毒特异性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，设计PCR引物序列和组合如下；第二步，提取微量海蛇毒基因DNA；第三步，采用第一步设计的任意一对引物对和第二步提取的DNA模板，进行PCR扩增反应。
[0011]作为本专利技术优选的技术方案，第三步中，所述PCR扩增反应的PCR反应体系包括：总体积20μl，10
×
PCR 缓冲液2.0μl；10
×
dNTPs 2.0μl；0.2-1.5μl上游引物（终浓度：0.2μmol/l-1.5μmol/l）；0.2-1.5μl下游引物（终浓度：0.2μmol/l-1.5μmol/l）；0.4μl
ꢀ-
2μl Taq酶（终浓度：0.1 U/μl
ꢀ–ꢀ
0.5U/μl）；DNA模板0.5μl；双蒸水10.5μl
ꢀ-
14.7μl补足20μl。
[0012]作为本专利技术技术方案，第三步中，所述PCR扩增的反应参数为：
优选的PCR反应参数如下：引物对1优选的PCR反应参数为：引物对2优选的PCR反应参数为：引物对3优选的PCR优选的PCR反应参数为：引物对4优选的PCR反应参数为：采用引物对5 的PCR反应参数为：
采用引物对6的PCR反应参数为：作为本专利技术优选的技术方案，第三步所述PCR扩增反应通过琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图像可见扩增条带；第三步所述PCR扩增反应完成后，对PCR扩增产物进行测序，测序结果经blast分析结果显示皆为海蛇基因的特异性序列。
[0013]作为本专利技术优选的技术方案，第二步具体为：取适量海蛇组织或毒素，置于离心管内，加入适量纯水及终浓度为100μg/ml PK（蛋白酶），37℃孵育，离心，吸上清置于另一离心管内，随后加入等体积平衡酚，振荡或颠倒彻底混匀，离心，吸取上清水相置于另一离心管内，加入等体积1：1混合平衡酚：氯仿，随后振荡或颠倒彻底混匀，离心，吸取上清水相置于另一离心管内，加入等体积氯仿，振荡或颠倒彻底混匀，离心，吸上清水相于另一管，加入冷无水乙醇冷冻保存10min以上，离心，丢弃上清，室温晾干，加入纯水，室温溶解，即得。
[0014]在本专利技术的第二方面，还提供快速检测海蛇及其毒素的特异性引物对，所述引物对选自以下引物对的任意一对或其互补序列，其序列为：
在本专利技术的第三方面，提供上述任意一对特异性引物对或其互补序列在制备鉴别海蛇毒的产品中的应用。
[0015]作为本专利技术优选的技术方案，所述产品为检测试剂、检测试纸、或检测试剂盒。
[0016]在本专利技术的第四方面，提供一种用于鉴别海蛇毒的检测试剂盒，包含上述任意一对特异性引物对或其互补序列。
[0017]作为本专利技术优选的技术方案，该试剂盒包括PCR扩增反应体系，该PCR扩增反应体系包括：总体积20μl，10
×
PCR 缓冲液2.0μl；10
×
dNTPs 2.0μl；0.2-1.5μl所述的上游引物；0.2-1.5μl所述的下游引物；0.4μl
ꢀ-
2μl Taq酶；DNA模板0.5μl；双蒸水10.5μl
ꢀ-
14.7μl。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：本专利技术利用现代分子生物学技术，首次从海蛇组织或海蛇毒样品尤其蛇毒中提取基因组DNA，虽然经琼脂糖凝胶电泳难以检测出基因组DNA，但其能够用于PCR检测。此外，通过设计多对引物，并进行PCR扩增验证，其中多对引物对经PCR反应扩增出多条带或不能出扩增条带，特异性较差，难以或不适用于检测。而其中6对引物对扩增的产物条带单一，特异性较好，经测序，显示为海蛇的特异性基因序列。综上本专利技术是一种操作简单，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海蛇毒特异性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，设计如下PCR引物或其互补序列；第二步，提取微量海蛇毒基因DNA；第三步，采用第一步设计的任意一对引物对和第二步提取的DNA模板，进行PCR扩增反应。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：第三步中，所述PCR扩增反应的反应体系包括：总体积20μl，10
×
PCR 缓冲液2.0μl；10
×
dNTPs 2.0μl；0.2-1.5μl上游引物；0.2-1.5μl下游引物；0.4μl
ꢀ-
2μl Taq酶；DNA模板0.5μl；双蒸水10.5μl
ꢀ-
14.7μl。3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：第三步中，所述PCR扩增的反应参数包括：。4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：引物对1的PCR反应参数为：
引物对2的PCR反应参数为：引物对3的PCR优选的PCR反应参数为：引物对4的PCR反应参数为：引物对5 的PCR反应参数为：引物对6的PCR反应参数为：。5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：第三步所述PCR扩增反应通过琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图像见扩增条带；第三步所述PCR扩增反应完成后，对PCR扩增产物进行测序，测序结果经blast分析结果显示皆为海蛇基因的特异性序列。6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：第二步具体为：取适量海蛇组织或毒素，置
于离心管内，加入适量纯水及终浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈则，张黎明，易应磊，柳国艳，周东，王博，范铁炯，王蓓蕾，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军特色医学中心，
类型：发明
国别省市：