一种鉴定三疣梭子蟹氨氮耐受性状的分子标记C13及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种鉴定三疣梭子蟹氨氮耐受性状的分子标记C13及其应用。所述分子标记C13是一种SNP标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第590位碱基为A或者G，氨氮耐受基因型为AA基因型。本发明专利技术还利用所述分子标记C13设计得到了一对有效的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的扩增引物。所述分子标记C13和其扩增引物能够从分子水平对耐氨氮的三疣梭子蟹个体进行鉴定和筛选，方法简单、准确可靠，有效加快耐氨氮三疣梭子蟹新品种的选育进程。选育进程。选育进程。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定三疣梭子蟹氨氮耐受性状的分子标记C13及其应用


[0001]本专利技术属于DNA分子标记
，具体涉及一种鉴定三疣梭子蟹氨氮耐受性状的分子标记C13及其应用。

技术介绍

[0002]三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）属节肢动物门，甲壳纲，十足目，梭子蟹科，梭子蟹属，为主要分布于渤海、黄海、东海的重要海产经济蟹类。因其肉味鲜美，营养丰富，含蛋白质、维生素A、B1、B12和尼克酸，以及钙、磷、铁等元素，深受国内外消费者喜爱。自上世纪90年代开始，三疣梭子蟹人工养殖在我国迅速发展，至2019年养殖年产量已达11.38万吨。然而，随着养殖集约化程度的提高，养殖密度不断增大，饵料投入不断增加，致使养殖水体中的氮源过剩。过剩的有机氮能够被转化无机氮。氨氮被认为是养殖水体中毒性最高的无机氮。氨氮积累能够显著抑制三疣梭子蟹生长，造成组织损伤，甚至导致个体的大量死亡。因此，氨氮耐受性状是三疣梭子蟹重要的选育性状之一，对于提高养殖成活率和提升养殖效益至关重要。
[0003]分子标记是指反映个体间DNA分子水平上遗传多态性的遗传标记。作为第三代分子标记，单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）具有丰富度高、密度大、稳定性强、共显性等特点，已在分子标记辅助育种中得到了广泛的应用。目前，关于三疣梭子蟹氨氮耐受的分子标记还未见报道。因此，开发耐氨氮性状相关的分子标记对三疣梭子蟹遗传选育具有重要的意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种鉴定三疣梭子蟹氨氮耐受性状的分子标记C13及其应用。所述分子标记C13能够准确高效的鉴定出三疣梭子蟹的氨氮耐受性状。
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种鉴定三疣梭子蟹氨氮耐受性状的分子标记C13，所述分子标记C13的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0006]进一步的，所述分子标记C13的核苷酸序列中第590位碱基为A或者G。
[0007]进一步的，所述分子标记C13的氨氮耐受基因型为AA基因型。
[0008]进一步的，所述分子标记C13为SNP标记。
[0009]本专利技术还提供了所述的分子标记C13的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
[0010]本专利技术还提供了所述的分子标记C13在用于筛选具有氨氮耐受性状的三疣梭子蟹品种中的应用。
[0011]进一步的，所述筛选的步骤为：提取三疣梭子蟹待测样品的DNA作为模板，利用所述分子标记C13的扩增引物C13
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Forward和C13
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Reverse进行PCR扩增，得到的PCR产物进行测序，若测序结果中所述分子标记C13的基因型为AA，则该三疣梭子蟹待测样品具有氨氮耐
受性状。
[0012]进一步的，所述PCR扩增的条件为：94 ℃预变性30 sec；98 ℃变性10 sec，55 ℃退火15 sec，72 ℃延伸10 sec，重复35个循环。
[0013]本专利技术还提供了所述的扩增引物在用于制备筛选三疣梭子蟹氨氮耐受品种的试剂中的应用。
[0014]本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：1. 本专利技术所述的SNP标记C13与三疣梭子蟹耐氨氮的性状紧密关联，通过分子标记C13能够从分子水平对耐氨氮的三疣梭子蟹个体进行鉴定和筛选，且方法简单、准确可靠，不受外界环境条件以及个体所处的生长发育阶段限制，还能够在早期进行选择，从而有效加快耐氨氮三疣梭子蟹新品种的选育进程。
[0015]2. 本专利技术的鉴定方法实用性强，对于三疣梭子蟹基因组DNA的提取方法和DNA测序的方法没有特定的要求，方法简单、高效，且检测的成本低，适用性广，可用于大范围筛选具有耐氨氮性状的个体，有效降低选育成本。因此，所述分子标记C13和通过该分子标记设计得到的引物对，以及鉴定方法均具有广阔的应用前景。
附图说明
[0016]图1为分子标记C13的部分测序结果。
具体实施方式
[0017]以下结合具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明。
[0018]本专利技术所用的三疣梭子蟹均取自中国水产科学研究院下营增殖站，选择体重为50
ꢀ±ꢀ
5g，且活力好、无伤痕的梭子蟹200只，放置于4个室内养殖池（500cm
×
300cm
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150cm）中暂养7d。暂养期间，水温保持在23
ꢀ±ꢀ
1℃，盐度为30
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1，pH为8.0
ꢀ±ꢀ
0.3，氨氮浓度低于0.01 mg/L，水深20 cm，持续供氧。每天上午8点更换已过滤的海水约1/2，下午投喂新鲜杂鱼，投喂量约为三疣梭子蟹总重量的1/5。
[0019]暂养结束后，将200只梭子蟹随机分配到4个室内养殖池中，每个养殖池放置50只。池内海水氨氮浓度已用氯化铵（NH4Cl）调至80 mg/L，其他水质条件均与暂养期间保持一致。氨氮胁迫的前48h，海水氨氮维持在80 mg/L，每2h记录三疣梭子蟹的死亡时间。48h后，逐渐将海水的氨氮浓度升高，每两天提升40 mg/L，记录养殖池中三疣梭子蟹的存活个体数量，直至剩余20只三疣梭子蟹时终止实验。氨氮胁迫过程中，最先死亡的20个三疣梭子蟹个体认为是氨氮敏感组（记为AS组），最后存活的20个个体认为是氨氮耐受组（记为AR组）。解剖上述三疣梭子蟹个体，取肌肉组织放置于冻存管中，在液氮中速冻，保存于
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80℃冰箱备用。
[0020]实施例1一、耐氨氮性状相关分子标记筛选1. 建库、测序和数据分析采用天根生化科技有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，通过硅基质材料吸附柱进行基因组DNA提取。具体步骤为：（1）取25 mg左右的三疣梭子蟹个体的肌肉组织，放入装有200 μl缓冲液GA的离心
管中，涡旋振荡15 sec，加入20 μl Proteinase K（20 mg/ml）溶液，涡旋混匀后，于56℃放置至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0021]（2）加入200 μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 min，至溶液变清亮，加入200 μl无水乙醇，充分颠倒混匀。
[0022]（3）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12,000 rpm离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD，12,000rpm离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0023]（4）向吸附柱CB3中加入600 μl漂洗液PW，12,000 rpm离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中，重复该步骤。
[0024]（5）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm (~13,400...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定三疣梭子蟹氨氮耐受性状的分子标记C13，其特征在于，所述分子标记C13的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述的鉴定三疣梭子蟹氨氮耐受性状的分子标记C13，其特征在于，所述分子标记C13的核苷酸序列中第590位碱基为A或者G。3.根据权利要求1所述的鉴定三疣梭子蟹氨氮耐受性状的分子标记C13，其特征在于，所述分子标记C13的氨氮耐受基因型为AA基因型。4.权利要求1所述的分子标记C13的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。5.权利要求1所述的分子标记C13在用于筛选具有氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟宪亮，王黛霞，吕建建，刘萍，李健，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：