一种仿刺参育种全基因组50KSNP芯片及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种仿刺参育种全基因组50KSNP芯片及应用，包括(1)仿刺参全基因组范围的50kSNP芯片的开发：通过构建仿刺参样品群体，全基因组范围的SNP分型，对仿刺参50KSNP标记筛选，HD

【技术实现步骤摘要】
一种仿刺参育种全基因组50K SNP芯片及应用

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[0001]涉及分子生物学、功能基因组学、生物信息学和分子育种领域，具体涉及一种与生长性状相关的SNP位点筛选，与仿刺参的基因组SNP芯片及制备方法,同时还涉及这种仿刺参SNP芯片的用途。

技术介绍
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[0002]分子标记(Molecular Markers)，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。遗传标记经历了4个发展阶段：形态学水平；细胞学和染色体水平；蛋白质和同工酶标记水平；DNA分子水平(朱玉贤,李毅,郑晓峰,郭红卫.现代分子生物学(第5版)[J]. 生命世界,2019(07):2.)。DNA分子标记相对之前的标记具有显著的优势：以DNA的形式表现，不受发育阶段和外界环境因素的限制，在生物体的各组织均可进行检测；标记在全基因组中呈均匀分布，数目多，多态性高，且在自然界中普遍存在，不需对生物进行人为改造，不会影响物种的自然状态，DNA分子标记的检测手段快速简便(李为民,李思锋,黎斌.DNA分子标记在野生大豆遗传多样性研究中的应用进展[J].中国农学通报,2014,30(21):246
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250.)；DNA标记多为选择中性，不会对生物性状造成影响。
[0003]以单核苷酸多态性(SNP)标记为代表的DNA分子标记技术，是分子标记技术的一种。与已有的标记相比较，SNP标记技术的具有显著的优势(朱向博,张丽.单核苷酸多态性及其在畜牧兽医领域的研究进展[J].现代畜牧兽医,2020(07):48
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51.)：由于在二倍体生物中SNP位点多以二等位多态的形式存在，因而较容易估计出各位点的等位基因的频率；由于其单核苷酸突变的特性，因而其在全基因范围内大量存在，与应用较为广泛的DNA分子标记
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微卫星标记相比，SNP标记在基因组中的分布更为广泛，并且更为稳定；对位于编码区内的SNP突变，可分为同义突变和非同义突变两类，非同义突变的SNP由于改变了基因转录翻译产物的蛋白质序列，可能会造成蛋白质结构或基因表达水平的改变，因此，对于编码区SNP的研究意义显得更为重大；SNP标记的筛查过程可实现快速、规模化，后续的数据分析过程基本为自动化，对缩短研究周期十分重要(方宣钧,农业,吴为人,唐纪良,生物遗传学.作物DNA标记辅助育种[M].科学出版社,2001.)；SNP标记在全基因组水平呈现不均匀分布的状态，自然界内的SNP突变绝大多数发生在基因组的非编码区。随着高通量测序技术的发展，基于测序手段的SNP筛查逐渐成为研究人员关注的热点。
[0004]全基因组重测序，虽能获取最为全面的基因组变异信息，但若应用于上百乃至上千个体的大规模分析，其测序成本仍较高。简化基因组或低深度重测序技术的出现，虽较好地降低了测序成本，但由于其测序位点的随机性，难于实现对许多重要性状相关的已知基
因或基因通路的全面覆盖和分型(Ruiqiang Li,Yingrui Li,Xiaodong Fang,HuanmingYang,Jian Wang,Karsten Kristiansen,Jun Wang.SNP detection for massively parallelwhole
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genome resequencing[J].Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2009,19(6).Xiangyang Xu,Guihua Bai.Whole
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genome resequencing:changingthe paradigms of SNP detection,molecular mapping and gene discovery[J].MolecularBreeding,2015,35(1).)。基因芯片技术是一种准确率高、重复性好的靶位点分型技术 ([1]Jay Shendure,Robi D.Mitra,Chris Varma,George M.Church.Advanced sequencingtechnologies:methods and goals[J].Nature Reviews Genetics,2004,5(5).)，在模式生物或农作物、畜禽的育种研究中应用广泛(Andreas Kranis,Almas A Gheyas,ClarissaBoschiero,Frances Turner,Le Yu,Sarah Smith,Richard Talbot,Ali Pirani,FionaBrew,Pete Kaiser,Paul M Hocking,Mark Fife,Nigel Salmon,Janet Fulton,Tim MStrom,Georg Haberer,Steffen Weigend,Rudolf Preisinger,Mahmood Gholami,SaberQanbari,Henner Simianer,Kellie A Watson,John A Woolliams,David W Burt. Development of a high density 600K SNP genotyping array for chicken[J].BioMedCentral,2013,14(1).)，但对仿刺参等养殖品种仍然缺乏成熟的商业化芯片(ShikaiLiu,Luyang Sun,Yun Li,Fanyue Sun,Yanliang Jiang,Yu Zhang,Jiaren Zhang,JianbinFeng,Ludmilla Kaltenboeck,Huseyin Kucuktas,Zhanjiang Liu.Development of thecatfish 250K SNP array for genome
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wide association studies[J].BioMedCentral,2014,7(1).)，定制费用较为昂贵，且固相芯片难以满足位点灵活选择的应用需求。HD
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marker技术是基于液相分子杂交的基因分型技术。该技术通过在单个PCR管内的高集成度探针杂交
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延伸
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连接反应，实现对多达上万个已知基因变异位点进行高通量筛查和分析相比固相芯片平台，由于HD
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Marker是基于引物池的方式进行芯片的合成，可根据实际研究需求增减位点，具有更高的使用灵活性。该技术将液相杂交反应的位点选择灵活性和高通量测序平台通量高、成本低的优势有效地结合，突破了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种仿刺参育种全基因组50K SNP芯片,其特征在于：所述的SNP芯片包括用于仿刺参育种的SNP标记组合以及用于仿刺参育种的液相育种芯片，所述用于仿刺参抗高温性状育种的SNP标记组合，由48755个SNP位点组成，SNP所在核苷酸序列分别为SEQ No.001
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SEQ ID No.48755所示序列，长度为49bp，所述用于仿刺参育种的液相育种芯片，由48755对探针序列，每个SNP位点对应两条探针序列，分别为Forward探针和Reverse探针。2.根据权利要求1所述的一种仿刺参育种全基因组50K SNP芯片，其特征在于：所述的仿刺参全基因组育种芯片在不同群体仿刺参的遗传背景分析中的作用。3.根据权利要求1所述的一种仿刺参育种全基因组50K SNP芯片，其特征在于：所述的仿刺参全基因组育种芯片在仿刺参性状关联分析中的应用。4.根据权利要求1所述的一种仿刺参抗高温育种低密度12K SNP芯片，其特征在于：所述一种仿刺参抗高温育种低密度12K SNP芯片在抗高温性状的全基因组选择育种值分析中的应用。5.根据权利要求1
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4所述的一种仿刺参育种全基因组50K SNP芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、在1.5ml的管中加入500ul STE裂解缓冲液，50ul 10％SDS,3.5ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K，16ul浓度为100mg/ml的RNase A，所述裂解缓冲液包括100mM NaCl、pH8.0的10mM Tris
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Cl以及pH8.0的1mM EDTA，取扇贝闭壳肌0.1克，加入，剪碎，研磨棒研磨，研磨至絮状，56℃处理2h，期间每隔30mins颠倒混匀一次，最终裂解液澄清状态，加入500ul的Tris饱和酚，100ul体积比例为24：1的氯仿/异戊醇，轻轻晃动20min，室温12000rpm离心10分钟；S2、抽取上清液至新的1.5ml的EP管中，加入300ulTris饱和酚，300ul体积比例为24：1氯仿/异戊醇，轻轻晃动20mins,室温12000rpm离心10分钟，重复步骤S2两至三遍，直至无蛋白层为止；S3、抽取上清，加入等体积500ul氯仿/异戊醇，轻轻晃动20min，室温8000rpm，常温离心10分钟，取上清加入1ml的冰无水乙醇，50ul醋酸钠(3M)，
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20℃放置40min，12000rpm离心10min，使核酸沉淀，弃上清，浓度为70％乙醇洗涤沉淀2次，每次8000rpm低温离心5min，干燥至乙醇全部挥发，加入30ul ddH2O溶解，再加0.75uL RNase于37℃消化RNA 1.5h，利用Qubit试剂盒进行对DNA进行定量，浓度为1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，提取的DNA放置在
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20℃保存备用；S4、利用Covaris破碎仪将提取的仿刺参基因组DNA进行打断处理，打断范围设置在350bp，利用基因组DNA建库试剂盒进行DNA片段的末端修复加A，然后两端连接上接头后进行扩增，利用带有Barcode的引物进行文库扩增，完成文库的构建，利用Qubit 2.0进行文库定量，在Illumina HiSeq X Ten PE150平台进行测序，使用Bwa软件的index命令、samtools的index命令、picard的CreateSequenceDictionary.jar构建参考序列的索引，利用Bwa
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mem命令将双末端测序r...

【专利技术属性】
技术研发人员：王杨帆，王孟秋，倪萍，吕佳，王师，胡景杰，包振民，
申请(专利权)人：中国海洋大学三亚海洋研究院，
类型：发明
国别省市：