一种超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法技术

本发明专利技术涉及一种高效、简单快速的超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法，包括标准曲线与内标配置，富集，去除杂质，洗脱，酶解，分析。本发明专利技术可实现利妥昔单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗三个单抗药同时监测；样品前处理操作简便，实验周期短，一天内可完监测，节省成本；省略蛋白变性、还原和烷基化步骤，省略固相萃取步骤；监测方法灵敏度高，特异性强，血浆用量少且前处理过程简单，准确度和精密度满足要求，可为相关的药物浓度监测提供一种可靠的方法。监测提供一种可靠的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法


[0001]本专利技术属于医疗
，涉及一种药物的监测方法，尤其涉及一种高效、简单快速的超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法。

技术介绍

[0002]单克隆抗体药物是以γ型免疫球蛋白(Immunoglobulin G)结构为基础的一类具有特殊治疗效果的蛋白质药物。1986年，美国FDA批准了第一个单克隆抗体药物Orthoclone上市，翻开了生物医药历史崭新的一页。目前，单克隆抗体药物已成功应用于癌症、自身免疫疾病、病毒感染和中枢神经紊乱等多种疾病的临床治疗。
[0003]随着单克隆抗体药物(单抗药)在肿瘤治疗领域越来越多的应用，而单抗药的疗效、毒副作用和耐药性等个体差异较大，因此对单抗药的治疗药物监测显得尤为重要。目前有液质联用法和免疫法两种方法用于单抗药的治疗药物监测。
[0004]免疫法是目前临床常用的方法，但其在单抗药的治疗药物监测中存在很多缺点，比如线性测量范围窄，多个指标不能联检，病人体内产生单抗药抗体影响监测、交叉反应，高特异性抗体的开发时间长和难以获得等缺点。
[0005]液质联用法因其具有免疫法不具有的优点，近年来成为治疗药物监测的一种高效方法。2020年5月由中国药理学会和中日友好医院发起的《抗肿瘤生物类似药治疗药物监测药学专家共识》中强烈推荐用液质联用法用于治疗药物监测。然而现有的液质联用方法存在操作流程多、耗时长、不能自动化等因素，严重限制了其在临床中的应用。
[0006]利妥昔单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗是目前临床最常用的3种抗肿瘤单抗药，因其具有广谱(数10种不同类型癌症)的抗肿瘤疗效，越来越多的被用于临床肿瘤治疗。目前尚缺乏高效且简单快速的液相色谱串联质谱法监测这三种血药浓度的方法。
[0007]中国专利(CN 110927297 A)公开了“一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法”，该方法同时检测了13种抗肿瘤药物，但前处理复杂，需要蛋白沉淀后干燥处理再复溶后过滤。
[0008]中国专利(CN 110045048 A)公开了“一种测定人血浆中两种抗肿瘤药物浓度的HPLC
‑
MSMS方法”，检测种类有限，且前处理采用蛋白沉淀后氮吹复溶，前处理复杂，这些方法在临床应用比较受限。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是为了建立一种更加高效，简便快速的液相色谱串联质谱测定血浆中利妥昔单抗(Rituximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)和西妥昔单抗(Cetuximab)的血药浓度方法，本专利技术通过Protein A偶联磁珠富集纯化血浆中的3种单抗药，优化传统操作操作步骤，利用超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中3种单克隆抗体药物浓度。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0011]一种超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法，所述监测方法包括以下步骤：
[0012]1)标准曲线与内标配置：用空白血浆配置不同浓度的利妥昔单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗的标准曲线溶液；将托珠单抗用PBS配置成内标溶液；
[0013]2)富集：Protein A偶联磁珠富集步骤1)上述3种单抗药；
[0014]3)去除杂质：洗去步骤2)得到的富集液中的非特异性蛋白和其它杂质；
[0015]4)洗脱：洗脱Protein A偶联磁珠上的3种单抗药；
[0016]5)酶解：将步骤4)得到的洗脱液冷冻浓缩干燥，使用消化酶酶解，得到酶解液经离心，取上清待用；
[0017]6)分析：对步骤5)得到的上清液进行液相色谱串联质谱法检测，得到分析结果。
[0018]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤1)中，标准曲线溶液的浓度为5，10，25，50，100，200，400和800μg/mL。
[0019]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤1)中，内标溶液的浓度为50μg/mL。
[0020]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤2)具体为，加PBS颠倒数下重悬protein A偶联磁珠，取30μL到样品槽中，加30μL样品和200μL内标溶液，孵育30min。
[0021]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤3)具体为：将步骤2)的富集液磁吸分离，弃去上清液，protein A偶联磁珠加入PBS洗去未结合蛋白和其它杂质，磁吸分离，弃上清，重复多次；再用去离子水洗多次。
[0022]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤4)具体为：向步骤3)得到单抗药中加入洗脱液洗脱。
[0023]作为本专利技术的一种优选方案，所述洗脱液为体积分数20％甲酸与80％甲醇水溶液。
[0024]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤5)具体为：向步骤4)的洗脱液中，加入碳酸氢铵配置的胰蛋白酶，酶解，加入甲酸终止酶解反应，离心，取上清至96孔板中。
[0025]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤6)中，色谱条件为：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18100
×
2.1mm 1.7μm，柱温40℃，进样体积2μL；流动相：流动相A为0.05％～0.15％甲酸水溶液，流动相B为0.05％～0.15％甲酸乙腈溶液；
[0026]色谱梯度：0
‑
1min，10％B；1
‑
6min，10％B
‑
27％B；6
‑
6.5min，27％B
‑
95％B；6.5
‑
7.2min，95％B；7.2
‑
7.8min，95％B
‑
10％B；7.8
‑
8min，10％B；8
‑
8.5min，10％B
‑
95％B；8.5
‑
9.8min，95％B；9.8
‑
10min，10％B；10
‑
11min，10％B。
[0027]为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本专利技术在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC
‑
MS/MS方法检测血浆中抗肿瘤药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，短时间内完成抗肿瘤药物的分离和检测。在不影响本专利技术效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.05％～0.15％甲酸水溶液，流动相B为0.05％～0.15％甲酸乙腈溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液。
[0028]在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本专利技术采用0.05％～0.1％甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液作为流动相，色谱柱型号：
ACQUITY UPLC BEH C18 100
×
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法，其特征在于，所述监测方法包括以下步骤：1)标准曲线与内标配置：用空白血浆配置不同浓度的利妥昔单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗的标准曲线溶液；将托珠单抗用PBS配置成内标溶液；2)富集：Protein A偶联磁珠富集步骤1)上述3种单抗药；3)去除杂质：洗去步骤2)得到的富集液中的非特异性蛋白和其它杂质；4)洗脱：洗脱Protein A偶联磁珠上的3种单抗药；5)酶解：将步骤4)得到的洗脱液冷冻浓缩干燥，使用消化酶酶解，得到酶解液经离心，取上清待用；6)分析：对步骤5)得到的上清液进行液相色谱串联质谱法检测，得到分析结果。2.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法，其特征在于，所述步骤1)中，标准曲线溶液的浓度为5，10，25，50，100，200，400和800μg/mL。3.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法，其特征在于，所述步骤1)中，内标溶液的浓度为30
‑
100μg/mL。4.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法，其特征在于，所述步骤2)具体为，加PBS颠倒数下重悬protein A偶联磁珠，取10
‑
50μL到样品槽中，加10
‑
50μL样品和50
‑
300μL内标溶液，孵育30min。5.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：将步骤2)的富集液磁吸分离，弃去上清液，protein A偶联磁珠加入PBS洗去未结合蛋白和其它杂质，磁吸分离，弃上清，重复多次；再用去离子水洗多次。6.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法，其特征在于，所述步骤4)具体为：向步骤3)得到单抗药中加入洗脱液洗脱。7.根据权利要求6所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴超超，薛建有，杨利娜，李鸣晖，高强，
申请(专利权)人：杭州佰辰医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：