一种适用于甘草膏赭曲霉毒素A的快速测定方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于甘草膏中赭曲霉毒素A快速准确的检测方法。通过选择提取溶剂、优化液

【技术实现步骤摘要】
一种适用于甘草膏赭曲霉毒素A的快速测定方法
专利

[0001]本专利技术涉及一种赭曲霉毒素A的检测方法，特别涉及一种适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速检测方法。

技术介绍

[0002]中药材在采收,加工,运输和储藏等过程中，受其自身因素和外界环境条件的影响均可能侵染多种真菌尤其产毒真菌，可能产生具有严重毒副作用的真菌毒素，进而影响中药及其产品的质量和安全性。真菌毒素对机体不表现出急性毒性，但在体内有较强的蓄积性，损害肝肾功能，严重威胁人类的身体健康,甚至生命安全。中药材种类繁多，霉变情况各异，真菌毒素的污染和残留水平及对药材质量的影响也差异较大。
[0003]赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，简称OTA)是赭色曲霉属和青霉属的几种真菌产生的有毒代谢产物，OTA的分子量为403.8，熔点169℃，为无色晶体，易溶于极性有机溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水。在紫外光下呈绿色荧光,最大吸收峰为333nm。该化合物相当稳定,一般的烹调和加工方法只有部分破坏，对人及多种动物具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性，国际癌症研究机构IARC将其确定为2B类致癌物。赭曲霉毒素是真菌毒素之一，是由纯绿青霉、赭曲霉及碳黑曲霉等产毒菌株侵染粮食、食品、饲料及其他农副产品后所产生的一种有毒代谢产物。同时赭曲霉毒素广泛存在于各种食物中，存在于谷物及其副产品、可可、咖啡、肉类、乳汁、干果、调味品、酒类、茶叶等中。目前，世界上有40多个国家和地区规定了粮食及其制品、果酒、干果及婴幼儿食品中OTA的限量。OTA与人类健康关系较为密切，是欧洲部分国家膳食中的主要污染物之一，因此受到全世界的广泛关注。
[0004]甘草为豆科植物甘草的干燥根和根茎，是一种常用的中药材。甘草在采收，加工，运输和储藏等过程中很易产生真菌毒素赭曲霉毒素A，甘草膏是甘草的浸汁浓缩产物，有微弱的特臭和持久的特殊甜味，黑褐色的固体。甘草膏的主要成分是甘草素，又称甘草精，甘草甙或甘草甜素(Glycyrrhizin)，为甘草酸 (Glycyrrhizin Acid)的钙盐、钾盐或钠盐。甘草膏中赭曲霉毒素A的残留量远远大于甘草中残留量。甘草膏作为较大宗的出口商品，主要有于医药、烟草和食品等工业，全世界每年需求1～2万吨。因此，甘草膏中赭曲霉毒素A的测定对于其质量安全和人类健康都有重要的意义。
[0005]目前，国内相关的标准和文献对于赭曲霉毒素A的检测范围主要适用于谷物、油料及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品、葡萄干、胡椒粒/粉、辣椒及其制品等、生咖啡、熟咖啡中。仅有少量文献报道甘草中赭曲霉毒素A的检测。国内没有任何相关标准和文献研究甘草膏中赭曲霉毒素A的测定。目前已有的赭曲霉毒素A的检测标准和文献方法均不适用甘草膏中赭曲霉毒素A的检测。国外对于赭曲霉毒素A研究主要集中谷类，干坚果，调味品类，酒类、咖啡类、婴幼儿食品中，仅有少量文献报道对于甘草和提取物中赭曲霉毒素A的检测。现有赭曲霉毒素A的检测方法中甲醇水、乙腈水和碳酸氢钠溶液均不能有效溶解甘草膏和提取其中的赭曲霉毒素A。目前常用的净化方法有免疫亲和柱和离子交换固相萃取柱，两种方法均不能有效净化甘草膏(甘草的浸汁高浓缩黑褐色的固体)中杂质，无法准确测定甘草膏
中赭曲霉毒素A含量。现有的检测方法中，仅有GB 5009.96
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2016食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定方法中的使用苯基硅烷固相萃取柱和免疫亲和柱两次净化后，可以有效净化甘草膏(甘草的浸汁高浓缩黑褐色的固体)中杂质，并能准确定量，但此法需要两次的柱净化过程，固相柱的成本较高，净化操作步骤多且耗时，测定的重复性不好，净化效果不好时，回收率也差，难以快速有效的准确测定甘草膏中赭曲霉毒素A的含量。因此，建立一种快速有效的适用于甘草膏中赭曲霉毒素A含量的检测方法具有重要的意义。

技术实现思路

[0006]针对目前尚未发现关于甘草膏中赭曲霉毒素A有效测定方法的报道，现有关赭曲霉素A检测的方法不能有效溶解甘草膏和提取赭曲霉毒素A，且前处理净化杂质的步骤多，处理成本高且操作繁琐，净化效果差，导致无法准确定量的技术现状，本专利技术旨在于提供一种快速有效的适用于甘草膏赭曲霉毒素A的检测方法。本专利技术通过筛选溶解甘草膏溶剂、优化液
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液萃取与反萃取净化方法、优化了免疫亲和柱净化的淋洗溶液等关键步骤，最终获得一种适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速准确检测方法。当提取液选用浓度为30g/L的NaHCO3水溶液与乙腈按照体积比60：40，甘草膏能完全溶解，离心后上清液调pH值为 2
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3时，采用三氯甲烷萃取两次，浓缩后再用提取液反萃取技术初净化和免疫亲和柱再净化后测定，简单快速，净化效果好，能有效去除杂质干扰，回收率高且稳定，方法用于甘草膏中赭曲霉毒素A的检测，检出率高达60％。本专利技术提供的适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的检测方法，有效解决了现有方法难以准确测定甘草膏中赭曲霉毒素A的问题，建立了一种低成本准确快速有效的甘草膏中赭曲霉毒素A含量的测定方法，为甘草膏中赭曲霉毒素A含量的测定提供了有效的检测技术。
[0007]本专利技术提供了一种适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速测定方法，具体包括如下步骤：
[0008](1)称取样品1.0g，加入20mL的NaHCO3水溶液和乙腈混合溶液，60℃下超声30min，第一次离心后取上清液，加入盐酸调节pH值至2
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3时，加入三氯甲烷，涡旋混匀萃取，第二次离心分离后取三氯甲烷，重复萃取一次，合并两次三氯甲烷约30mL，旋蒸至1
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2mL溶液，加入20mL的NaHCO3水溶液和乙腈混合溶液，混合后第三次离心分离，取4mL上清液待净化。
[0009](2)将步骤(1)上清液加入PBST溶液稀释，涡旋混匀后过免疫亲和柱净化，依次用5mLPBST和5mL水淋洗免疫亲和柱后挤干；用2.5mL的浓度为2％的乙酸甲醇洗脱并收集试管中。
[0010](3)将步骤(2)中收集试管中的流出液于40℃下氮气吹干，用0.5mL混合溶剂溶解，涡旋后过PTFE膜。
[0011](4)配制标准工作溶液制作标准曲线，以外标法定量。
[0012](5)过膜后的溶液上液相色谱荧光检测法检测。
[0013]本专利技术提供的适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速测定方法中，所述步骤 (1)中NaHCO3溶液和乙腈的体积比为60：40，NaHCO3水溶液的浓度为30g/L，盐酸的浓度为5mol/L，pH值2
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3时，三氯甲烷萃取两次，萃取液旋蒸至1
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2mL 溶液，用NaHCO3溶液和乙腈混合溶液来反萃取。
[0014]本专利技术提供的适用于甘草膏赭曲霉毒素A的快速测定方法中，所述步骤(2) 中
PBST溶液为氯化钠8.0g、磷酸氢二钠1.2g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钾0.2g，用水溶解，调节PH至7.0，加入1mL吐温
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20，加水定容至1L。用5mLPBST 和5mL水淋洗免疫亲和柱后挤干；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速测定方法，其特征在于，该测定方法具体包括如下步骤：(1)称取样品1.0g，加入20mL的NaHCO3水溶液和乙腈混合溶液，60℃下超声30min，第一次离心后取上清液，加入盐酸调节pH值至2
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3时，加入三氯甲烷后涡旋混匀萃取；第二次离心分离后取三氯甲烷层，重复萃取一次，合并三氯甲烷约30mL，旋转蒸发至1
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2mL溶液，加入20mL的NaHCO3溶液和乙腈混合的提取液，混合后第三次离心分离，取4mL上清液待净化；(2)将步骤(1)上清液加入PBST溶液稀释，涡旋混匀后过免疫亲和柱净化，依次用5mLPBST和5mL水淋洗免疫亲和柱后挤干，用2.5mL的浓度为2％的乙酸甲醇洗脱并收集试管中；(3)将步骤(2)中收集试管中的流出液于40℃下氮气吹干，用0.5mL混合溶剂溶解，涡旋后过PTFE滤膜；(4)配制标准工作溶液制作标准曲线，以外标法定量；(5)过膜后溶液上液相色谱荧光检测器法检测。2.如权利要求1所述的一种适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中NaHCO3水溶液和乙腈...

【专利技术属性】
技术研发人员：巩志国，房芳，苏敏，王静静，何璐，齐冬琴，姚伟琴，李晓岩，彭静怡，
申请(专利权)人：乌鲁木齐海关技术中心，
类型：发明
国别省市：