用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡、其制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡、其制备方法及应用。其中，该融合细胞膜纳米囊泡由两种或两种以上来自不同来源细胞的细胞膜囊泡融合而成，来自不同来源细胞的细胞膜囊泡过表达了不同的免疫检查点对应的受体。本发明专利技术的融合细胞膜囊泡不需要复杂的设计和制备，不会带来免疫毒性；不仅相对于具有单一靶向标记的细胞膜囊泡来说改善了治疗效果，而且相对于简单混合使用具有不同靶向标记的细胞膜囊泡的鸡尾酒疗法来说，也改善了治疗效果；另外，融合细胞膜囊泡中的单细胞膜囊泡组件可以单独定制，使得结构具有高自由度，可选择靶向多种不同的肿瘤细胞；又由于肿瘤细胞膜的同源靶向性与免疫抗原，可同时提高多种肿瘤的治疗效果。高多种肿瘤的治疗效果。高多种肿瘤的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡、其制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体而言，涉及一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡、其制备方法及应用。

技术介绍

[0002]免疫检查点阻断疗法(ICB疗法)属于肿瘤免疫疗法。其中，免疫阻断点包括适应性和先天性的免疫阻断点，比如PD
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L1和CD47。作为一种适应性的免疫阻断点，PD
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L1可以抑制抗肿瘤T细胞的活性和通过PD
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1受体来减少抗肿瘤适应性的免疫响应，因此，PD
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L1/PD
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1信号通路的中断可以恢复抗肿瘤T细胞的免疫响应。作为一种先天的免疫阻断点，CD47可以通过与它的受体(信号调控蛋白SIRPα)相互作用减少巨噬细胞的吞噬作用。因此，阻断CD47和SIRPα信号通路也可以抑制肿瘤的生长。
[0003]由于PD
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L1和CD47都可以在肿瘤细胞上过表达，分别充当至关重要的适应性和先天的阻断点，它们是否在免疫调控方面具有协同作用变得非常有吸引力。但同时也存在着一定的技术问题，例如：FU Y X，LIU X J.Dual targeting of innate and adaptive checkpoints on tumor cells limits immune evasion[J].Cancer Research,2018,78(13).公开了一种融合蛋白，可以同时阻断PD
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L1和CD47，展示了相对于单一阻断点更好的治疗效果。但是融合蛋白技术需要复杂的设计和隔离，并且不具有肿瘤靶向性，还会带来蛋白毒性。又如，ZHANG X D，WANG C，WANG J Q，et al.PD
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1Blockade Cellular Vesicles for Cancer Immunotherapy[J].Advanced Materials,2018,30(22).公开了在过表达PD
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1的单一细胞膜囊泡用于肿瘤的免疫治疗。但是这种方法对于同时表达有PD
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L1和CD47的肿瘤细胞来说，只阻断PD
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L1/PD
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1信号通路，其治疗效果并不好。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在提供一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡、其制备方法及应用，以改善肿瘤免疫治疗的效果。
[0005]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡。该融合细胞膜纳米囊泡由两种或两种以上来自不同来源细胞的细胞膜囊泡融合而成，来自不同来源细胞的细胞膜囊泡过表达了不同的免疫检查点对应的受体。
[0006]进一步地，免疫检查点对应的受体包括SIRPα变体、PD
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1、CLTA
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4、TIM3、LAG3和VISTA。
[0007]进一步地，不同来源细胞包括过表达SIRPα变体的4T1细胞和过表达PD
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1的B16F10细胞。
[0008]根据本专利技术的另一个方面，提供一种上述融合细胞膜纳米囊泡的制备方法。该制备方法包括以下步骤：选取两种或两种以上的肿瘤细胞的免疫检查点，通过对细胞进行基因工程化得到过表达免疫检查点对应的受体的细胞，其中，过表达免疫检查点对应的受体
的细胞为两种或两种以上，每种过表达免疫检查点对应的受体的细胞过表达一种或多种免疫检查点对应的受体；分别制备衍生于过表达免疫检查点对应的受体的细胞的单一细胞膜囊泡组分；以及融合两种或两种以上单一细胞膜囊泡组分，得到融合细胞膜纳米囊泡。
[0009]进一步地，融合两种或两种以上单一细胞膜囊泡组分包括：将两种或两种以上单一细胞膜囊泡组分混合，超声处理，然后在通过微型推挤机挤出，形成融合细胞膜纳米囊泡；优选的，微型推挤机的孔径为100～400nm；优选的，超声处理的时间为5～20分钟；优选的，用DLS监测融合两种或两种以上单一细胞膜囊泡组分的过程；更优选的，在通过微型推挤机挤出前，各单一细胞膜囊泡组分用不同的标记物进行标记。
[0010]进一步地，单一细胞膜囊泡组分的制备包括：用低渗裂解缓冲液和均质器破坏过表达免疫检查点对应的受体的细胞，得到第一溶液；用DNase和RNase处理第一溶液，然后离心收集细胞膜囊泡；用PBS混合蛋白酶抑制剂洗涤细胞膜囊泡，然后细胞膜囊泡经过超声处理后，在微型推挤机上通过400，200，100nm纳米孔聚碳酸酯膜逐步挤压得到单一细胞膜囊泡组分。
[0011]进一步地，过表达免疫检查点对应的受体的细胞包括过表达SIRPα变体的4T1细胞和过表达PD
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1的B16F10细胞。
[0012]进一步地，对细胞进行基因工程化包括：用携带有与小鼠SIRPα跨膜域融合的SIRPα变体的慢病毒转染4T1细胞后，分选并亚克隆4T1细胞，得到过表达SIRPα变体的4T1细胞；将小鼠PD
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1克隆到在C端带有DsRed标记的pCMV6哺乳动物表达载体中，然后转染B16F10细胞，得到过表达PD
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1的B16F10细胞。
[0013]根据本专利技术的又一个方面，提供一种用于肿瘤免疫治疗的药物。该药物包括上述任一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡，或上述任一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡的制备方法制备得到的融合细胞膜纳米囊泡，以及医学上可以接受的载体；优选的，医学上可以接受的载体包括磷脂纳米颗粒。
[0014]进一步地，药物还包括包裹在融合细胞膜纳米囊泡内的化疗药物和/或小分子核酸药物。
[0015]根据本专利技术的再一个方面，提供上述任一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡，或上述任一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡的制备方法制备得到的融合细胞膜纳米囊泡在制备用于肿瘤免疫治疗的药物中的应用。
[0016]应用本专利技术的技术方案，融合细胞膜囊泡不需要复杂的设计和隔离，不会带来蛋白毒性；不仅相对于具有单一靶向标记的细胞膜囊泡来说改善了治疗效果，而且相对于简单混合使用具有不同靶向标记的细胞膜囊泡的鸡尾酒疗法来说，也改善了治疗效果；另外，融合细胞膜囊泡中的单细胞膜囊泡组件可以各自制定，使得结构具有高自由度，可选择靶向多种不同的肿瘤细胞；又由于肿瘤细胞膜的同源靶向性，可同时提高多种肿瘤的治疗效果。
附图说明
[0017]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：
[0018]图1示出了Fus
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CVs的制备和表征，其中图1中的a示出了在原始的和基因工程化的
4T1细胞的SIRPα表达(标尺棒：10微米)；b示出了在原始的和基因工程化的B16F10细胞的PD
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1表达(标尺棒：10微米)；c示出了Fus<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述融合细胞膜纳米囊泡由两种或两种以上来自不同来源细胞的细胞膜囊泡融合而成，来自不同来源细胞的所述细胞膜囊泡过表达了不同的免疫检查点对应的受体。2.根据权利要求1所述的融合细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述免疫检查点对应的受体包括SIRPα变体、PD
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1、CLTA
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4、TIM3、LAG3和VISTA。3.根据权利要求1或2所述的融合细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述不同来源细胞包括过表达SIRPα变体的4T1细胞和过表达PD
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1的B16F10细胞。4.一种如权利要求1至3中任一项所述的融合细胞膜纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：选取两种或两种以上的肿瘤细胞的免疫检查点，通过对细胞进行基因工程化得到过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞，其中，过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞为两种或两种以上，每种过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞过表达一种或多种所述免疫检查点对应的受体；分别制备衍生于过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞的单一细胞膜囊泡组分；以及融合两种或两种以上所述单一细胞膜囊泡组分，得到所述融合细胞膜纳米囊泡。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述融合两种或两种以上所述单一细胞膜囊泡组分包括：将两种或两种以上所述单一细胞膜囊泡组分混合，超声处理，然后在通过微型推挤机挤出，形成所述融合细胞膜纳米囊泡；优选的，所述微型推挤机的孔径为100～400nm；优选的，所述超声处理的时间为5～20分钟；优选的，用DLS监测融合两种或两种以上所述单一细胞膜囊泡组分的过程；更优选的，在所述通过微型推挤机挤出前，各所述单一细胞膜囊泡组分用不同的标记物进行标记。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述单一细胞膜囊泡组分的...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶浪，
申请(专利权)人：深圳湾实验室，
类型：发明
国别省市：