双重细胞膜包裹负载siEFNA1蛋黄脂质纳米药物及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种双重细胞膜包裹负载siEFNA1蛋黄脂质纳米药物及制备方法和应用，该纳米药物以蛋黄脂质纳米载体EYLNs为核心，负载siEFNA1，同时包裹食管鳞癌细胞膜及中性粒细胞膜。siEFNA1的负载可抑制食管鳞癌细胞的转移能力，中性粒细胞膜的包裹可增加纳米药物的肿瘤靶向富集，而食管鳞癌细胞膜的包裹可有效增加抗食管鳞癌免疫应答，具有更为有效的抗食管鳞癌作用。抗食管鳞癌作用。抗食管鳞癌作用。

【技术实现步骤摘要】
双重细胞膜包裹负载siEFNA1蛋黄脂质纳米药物及制备方法和应用


[0001]本专利技术属肿瘤靶向治疗领域，涉及用于肿瘤靶向治疗的纳米药物，具体涉及食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜包裹的、同时负载siEFNA1的蛋黄脂质纳米药物 NEM/EYLNs
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siEFNA1及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]随着纳米科技的发展，纳米药物的开发成为肿瘤靶向治疗研究的热点。纳米 药物须兼备实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)介导的被动靶向效应及各 种修饰介导的主动靶向效应以发挥其高效的抗肿瘤作用。同时，各种细胞膜介导 的仿生纳米可以有效逃避机体的免疫清除，有效延长纳米药物在机体的循环时间， 进一步增强了纳米药物在肿瘤部位的蓄积。

技术实现思路

[0003]本专利技术的第一个目的在于提供一种食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜包裹的、同时负载siEFNA1的蛋黄脂质纳米药物NEM/EYLNs
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siEFNA1；本专利技术的第二个目的在于提供NEM/EYLNs
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siEFNA1的制备方法；本专利技术的第三个目的在于提供纳米药物NEM/EYLNs
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siEFNA1在食管鳞癌治疗方面的应用。
[0004]本专利技术的技术解决方案是：一种食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜包裹的、同时负载siEFNA1的蛋黄脂质纳米药物NEM/EYLNs
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siEFNA1，该纳米药物以蛋黄脂质纳米EYLNs为核心，负载具有显著食管鳞癌细胞转移抑制作用的siEFNA1，并进行食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜包裹。
[0005]更进一步的是，以该纳米药物为核心，制备负载其它治疗性制剂的其它纳米药物体系。
[0006]其中，该纳米药物的制备方法包括以下步骤：
[0007](1)蛋黄脂质载体EYLNs的制备：向分装并干燥的脂质安剖瓶中加入200
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400μL的ddH2O，FS60水浴超声15
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20min至透亮，然后将其经50nm孔径的滤膜反复滤过后置于4℃备用；
[0008](2)携带siEFNA1的纳米载体EYLNs
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siEFNA1的制备：将预制备的EYLNs载体3mg与33μg聚醚酰亚胺PEI于室温震荡孵育1h， 15000rpm离心20min后加入500μL的ddH2O，每3min水浴超声1次，共超声处理3次；然后加入5nmol的siEFNA1，并于室温震荡孵育30min，15000 rpm离心5min去除游离siEFNA1；
[0009](3)中性粒细胞膜及食管鳞癌细胞膜的提取：所述的中性粒细胞膜的提取是，分离人外周血中性粒细胞；将细胞重悬于均质化缓冲液中，然后于冰上通过手动均质器反复均质处理100次左右；最后经蔗糖密度梯度离心分离纯化细胞膜；所述的食管鳞癌细胞KYSE
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150膜的提取方法同中性粒细胞膜的提取；
[0010](4)中性粒细胞膜、食管鳞癌细胞膜包裹EYLNs
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siEFNA1：将离心收集的中性粒细胞膜与肿瘤细胞膜分别按照不同比例混合后以ddH2O重悬，再相混匀，冰浴超声10min至清亮，得到中性粒细胞膜/肿瘤细胞膜融合膜纳米颗粒；将融合细胞膜纳米颗粒与EYLNs
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siEFNA1冰上孵育10min后冰浴超声3次，每次3min，得NKM/EYLNs
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siEFNA1纳米药物。
[0011]所述步骤(3)中，L缓冲液中组分如下：10mmol/L的MgCL2，1mmol/L 的KCL，10μg/mL的RNase，10μg/mL的DNase及1
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蛋白酶抑制剂cocktail。
[0012]所述步骤(3)中，蔗糖的质量百分比密度梯度是：30％，40％及55％。
[0013]所述步骤(4)中，离心收集的中性粒细胞膜与肿瘤细胞膜的混合质量比是： 1:2，1:1，2:1。
[0014]其中，该纳米药物应用于食管鳞癌治疗中。
[0015]本专利技术的优点是：以天然蛋黄脂质纳米载体EYLNs为核心，构建了一种食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜包裹的、同时负载siEFNA1的纳米药物 NEM/EYLNs
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siEFNA1，以期通过EYLNs载体被动靶向作用介导的siEFNA1靶向递送、中性粒细胞膜介导的主动靶向以及食管鳞癌膜介导的抗食管鳞癌免疫应答的增强实现更为有效的食管鳞癌治疗效果。
附图说明
[0016]图1为中性粒细胞膜、食管鳞癌细胞膜提取、鉴定以及融合膜包裹的EYLNs 载体鉴定；其中：A，SDS
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PAGE电泳鉴定中性粒细胞膜蛋白；B，SDS
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PAGE电泳鉴定食管鳞癌细胞膜蛋白；C，SDS
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PAGE电泳鉴定食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞融合膜。
[0017]图2为激光共聚焦鉴定不同比例食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜包裹的 EYLNs
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siEFNA1载体。
[0018]图3为不同比例食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜包裹的纳米药物组织分布分析；其中，A，荧光DiR标记的三种比例膜包被的纳米药物荧光强度检测；B，三个纳米药物在食管鳞癌皮下荷瘤小鼠组织中的分布检测及定量；C，三个纳米药物在食管鳞癌肺转移模型小鼠组织中的分布检测及定量。
[0019]图4为1:1比例膜包裹的纳米药物形态及粒径分布分析；其中，A，1:1比例膜包裹的纳米药物的电镜形态；B，1:1比例膜包裹的纳米药物粒径分布。
[0020]图5为纳米药物注射小鼠后免疫应答及对食管鳞癌肺转移能力的影响；其中， A，纳米药物注射后小鼠肿瘤细胞膜特异性IgG水平；B，纳米药物注射后小鼠肿瘤细胞膜特异性IgG1水平；C，纳米药物注射后小鼠肿瘤细胞膜特异性IgG2a 水平。
[0021]图6为纳米药物注射后对食管鳞癌细胞肺转移能力的抑制作用分析。
具体实施方式
[0022]下面结合实施例进一步说明本专利技术的技术解决方案，但不能理解为是对技术方案的限制，在此基础上的适应性改进皆属于本专利技术的保护范围。
[0023]1、NEM/EYLNs
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siEFNA1的构建：
[0024](1)蛋黄脂质载体EYLNs的制备：向分装并干燥的脂质安剖瓶中加入200
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400 μL的ddH2O，水浴超声(FS60)15
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20min至透亮，然后将其经50nm孔径的滤膜反复滤过后置于4℃备用；
[0025](2)携带siEFNA1的纳米载体EYLNs
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siEFNA1的制备：将预制备的EYLNs载体(3mg)与聚醚酰亚胺PEI(33μg)于室温震荡孵育1h，15000rpm离心20min后加入500μL ddH2O，每3min水浴超声1次，共超声处理3次；然后加入5nmol的siEFNA1并于室温震荡孵育30min本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.双重细胞膜包裹负载siEFNA1蛋黄脂质纳米药物，其特征是：所述纳米药物以蛋黄脂质纳米载体EYLNs为核心，负载抑制食管鳞癌细胞转移的siEFNA1，并对载体进行食管鳞癌细胞膜、中性粒细胞膜的包裹。2.根据权利要求1所述的双重细胞膜包裹负载siEFNA1蛋黄脂质纳米药物的制备方法，其特征是：该制备方法包括以下步骤：(1)蛋黄脂质载体EYLNs的制备：向分装并干燥的脂质安剖瓶中加入200
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400μL的ddH2O，FS60水浴超声15
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20min至透亮，然后将其经50nm孔径的滤膜反复滤过后置于4℃备用；(2)携带siEFNA1的纳米载体EYLNs
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siEFNA1的制备：将预制备的EYLNs载体3mg与33μg聚醚酰亚胺PEI于室温震荡孵育1h，15000rpm离心20min后加入500μL的ddH2O，每3min水浴超声1次，共超声处理3次；然后加入5nmol的siEFNA1，并于室温震荡孵育30min，15000rpm离心5min去除游离siEFNA1；(3)中性粒细胞膜及食管鳞癌细胞膜的提取：所述的中性粒细胞膜的提取是，分离人外周血中性粒细胞；将细胞重悬于均质化缓冲液中，然后于冰上通过手动均质器反复均质处理100次左右；最后经蔗糖密度梯度离心分离纯化细胞膜；所述的食管鳞癌细胞KYSE
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150膜的提取方法同中性粒细胞膜的提取；(4)中性粒细胞膜、食管鳞癌细胞膜包裹EYLNs

【专利技术属性】
技术研发人员：王其龙，张莉，隽雅丽，
申请(专利权)人：王其龙，
类型：发明
国别省市：