一种重组巴斯德毕赤酵母菌株、其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种重组巴斯德毕赤酵母菌株其构建方法和应用。一种产脂肪酸的重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，包括：构建具有SEQ ID NO：1所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ

【技术实现步骤摘要】
一种重组巴斯德毕赤酵母菌株、其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于微生物基因工程与代谢工程应用领域，具体涉及一种利用甲醇生产脂肪酸衍生物的重组巴斯德毕赤酵母的构建方法、优化及其应用。

技术介绍

[0002]当前世界快速发展的城市化建设与工业化进程导致了前所未有的对于化石燃料的依赖性，液体运输燃料的需求量逐年递增。目前，全世界三分之一的能源来自于石油原料，其余来自煤炭、天然气、核能、水电和可再生能源(BP,2014)，而大约80％的液体燃料来自石油(Floudas et al.Comput.Chem.Eng.,2012,41:24-51.)石油资源储备的快速消耗以及化石燃料使用产生的温室气体排放导致的气候变化等问题，已经成为现代社会面临的最大挑战之一，也促使人们寻找可以替代化石燃料的廉价可再生能源。燃料乙醇是目前最主要的生物燃料，可以大幅较少二氧化碳的排放，然而其带来的粮食与经济问题，以及燃料乙醇本身能量密度低和吸湿性限制其广泛应用(Hu et al.Open.Biol.,2019,9:190049.)。
[0003]脂肪酸类衍生物如脂肪醇、烷烃和烯烃等因其与当前使用的液体燃料具有相似的高能量密度和燃烧特性，可以用作航空与重型卡车燃料，是一种比生物乙醇更好的石油资源替代品(Sheng et al.Front.Microbiol.,2015,6:554.)。此外，脂肪酸及其衍生物也是重要的化工原料，如脂肪酸可以用来制造洗涤剂和表面活性剂；脂肪醇广泛应用于医药、化妆品、洗涤剂和护肤品的生产过程；α泛烯烃是制备航空燃料和高端润滑油的重要原料(Liu et al.Microb.Cell.Fact.,2016,15:129；Zhou et al.Nat.Energy.,2018,3:925-935.)。BCC Research调查报告显示2018年全球天然脂肪酸市场接近135亿美元，而这一数据到2023年将增至175亿美元，2018-2023年期间复合年增长率(CAGR)为5.4％。脂肪酸类衍生品市场规模将从2018年的69亿美元增长到2023年的近95亿美元，年复合增长率为6.4％(BCC Research LLC，2018)。
[0004]由于脂肪酸及其衍生物的结构特性，化学合成法过程复杂，成本较高，从自然生物来源的数量又十分有限，因此亟需开发新型高效的生产工艺来满足日益增长的需求，随着合成生物学与代谢工程的发展，以微生物细胞工厂作为脂肪酸及其衍生物的生产平台逐渐成为一种高效经济的补充方法。目前也有大量研究已经专注于该领域的研究，开发了不同菌株的生产平台，如酿酒酵母、大肠杆菌、红球菌等。在大肠杆菌中，通过合成基因模块化转录水平调控，平衡了前体供应与消耗过程，并通过酶的核糖体结合位点改造提升了蛋白质的翻译效率，工程菌株经分批补料发酵，脂肪酸的最终产量可以达到8.6g/L(Xu et al.Nat.Comm.,2013,4:1409.)。在酿酒酵母中，通过整合细胞质柠檬酸裂解途径，增强乙酰辅酶A供应，敲除脂肪酸β氧化途径基因等改造，在摇瓶发酵水平实现了1g/L的脂肪酸产量，经生物反应器中分批补料发酵，产量达到10.4g/L(Zhou et al.Nat.Comm.,2016,7:11709.)。在此基础上，进一步强化碳源流向乙酰辅酶A过程，增强辅酶NADPH与ATP供给等改造，结合实验室适应性进化手段，将酿酒酵母完全改造成为产油酵母，分批补料脂肪酸产量达到33.4g/L(Yu et al.Cell.,2018,174(6):1549-1558.)。在红球菌中，首先通过培养条
件的优化，可以生产82.9g/L的三酰甘油，再敲除酰基辅酶A合成酶，并过表达脂肪酶特异性折叠酶和三种脂肪酶，工程菌可以生产50.2g/L的游离脂肪酸(Kim et al.Nat.Chem.Biol.,2019,15(7):721-729.)。
[0005]现有的脂肪酸及其衍生物的生产底物主要是葡萄糖，虽然葡萄糖是一种微生物的最适碳源，但其来源于粮食受地理气候、经济等因素影响较大。因此需要寻找一种更廉价的生产原料作为替代。甲醇是最简单的一元醇，主要来自煤化工行业的副产物和天然气的催化合成，生产工艺成熟，是一种来源广泛，价格低廉的可再生资源(Price et al.PNAS,2016,113:12691-12696.)。由于我国的能源结构是“缺油、少气、富煤”的特点，所以近年来国内甲醇产能、产量大幅增长。与常用的发酵底物糖类相比，甲醇具有更强的还原力，能够为异源产物的合成提供更多的驱动力(Whitaker et al.Curr.Opin.Biotechnol.,2015,33:165-175.)，甲醇这种低价格高体量高能效的特点使其成为一种潜在的原料，甲醇的生物炼制将极大的拓展已有的甲醇转化路线，实现煤炭资源的清洁利用。
[0006]巴斯德毕赤酵母是一种天然甲基营养型酵母，可以在以甲醇培养基中快速生长，并且能够实现高密度培养，同时毕赤酵母也有较为成熟的异源蛋白表达系统，因此巴斯德毕赤酵母是一种非常具有潜力的微生物细胞工厂底盘。但是，目前在毕赤酵母中生产脂肪酸及其衍生物，尤其是以甲醇为底物的研究还未见报道。因此，本专利技术旨在构建毕赤酵母甲醇转化生产脂肪酸的高产菌株，一方面拓宽甲醇利用和脂肪酸生产的路线，另一方面探索了毕赤酵母作为微生物细胞工厂的应用潜力与前景。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种产脂肪酸、脂肪醇和α-烯烃的巴斯德毕赤酵母的构建方法、优化及其应用。
[0008]本专利技术的第一方面，提供一种高产脂肪酸的毕赤酵母菌株的构建方法，能够显著增加细胞生产脂肪酸的能力，脂肪酸积累量达1.1g/L以上。
[0009]所述构建方法包括：构建具有SEQ ID NO：1所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gFAA1；将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gFAA1导入巴斯德毕赤酵母菌株，敲除毕赤酵母菌株中的KpFAA1基因。
[0010]其中，所述巴斯德毕赤酵母菌株整合有Cas9蛋白。
[0011]可选地，所述构建方法还包括：构建具有SEQ ID NO：2所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gFAA2；将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gFAA2导入巴斯德毕赤酵母菌株，敲除巴斯德毕赤酵母菌株中的KpFAA2基因。
[0012]可选地，所述构建方法还包括：构建具有SEQ ID NO：3所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPOX1；将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPOX1导入巴斯德毕赤酵母菌株，敲除巴斯德毕赤酵母菌株中的KpPOX1基因。
[0013]在一个具体实施方式中，敲除编码脂酰辅酶A合成酶的基因KpFAA1和KpFAA2以及编码脂酰辅酶A氧化酶的基因KpPOX1。
[0014]进一步地，上述技术方案的具体步骤是：以无缝敲除基因KpFAA1为例，本专利技术对巴斯德毕赤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产脂肪酸的重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：构建具有SEQ ID NO：1所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gFAA1；将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gFAA1导入巴斯德毕赤酵母菌株，敲除巴斯德毕赤酵母菌株中的KpFAA1基因。优选地，所述巴斯德毕赤酵母菌株整合有Cas9蛋白。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：构建具有SEQ ID NO：2所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gFAA2；将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gFAA2导入巴斯德毕赤酵母菌株，敲除巴斯德毕赤酵母菌株中的KpFAA2基因；优选地，所述构建方法还包括：构建具有SEQ ID NO：3所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPOX1；将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPOX1导入巴斯德毕赤酵母菌株，敲除巴斯德毕赤酵母菌株中的KpPOX1基因；优选地，所述构建方法还包括：使所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达由基因MmACL编码的柠檬酸裂解酶、由基因KpIDP2编码的异柠檬酸脱氢酶2和由基因ScYHM2编码的柠檬酸转运蛋白；其中，所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达来自毕赤酵母的基因KpRAD52并且敲除了KpFAA1基因；进一步优选地，使所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达由基因MmACL编码的柠檬酸裂解酶包括：将来源于小家鼠的基因MmACL整合至所述重组巴斯德毕赤酵母菌株中；进一步优选地，使所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达由基因MmACL编码的柠檬酸裂解酶包括：构建具有SEQ ID NO：7所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPNSI-2；将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPNSI-2导入所述重组巴斯德毕赤酵母菌株；进一步优选地，使所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达由基因KpIDP2编码的异柠檬酸脱氢酶2包括：将来源于毕赤酵母的KpIDP2整合至巴斯德毕赤酵母基因组PNSI-3位点，使KpIDP2基因过表达；进一步优选地，使所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达由基因KpIDP2编码的异柠檬酸脱氢酶2包括：构建具有SEQ ID NO：9所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPNSI-3；将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPNSI-3导入所述重组巴斯德毕赤酵母菌株；进一步优选地，使所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达由基因ScYHM2编码的柠檬酸转运蛋白包括：将来源于酿酒酵母的基因ScYHM2整合至所述重组巴斯德毕赤酵母菌株中；进一步优选地，使所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达由基因ScYHM2编码的柠檬酸转运蛋白包括：构建具有SEQ ID NO：10所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPNSI-4；
将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPNSI-4导入所述重组巴斯德毕赤酵母菌株；优选地，KpFAA1基因具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；KpFAA2基因具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；KpPOX1基因具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；MmACL基因具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；KpIDP2基因具有如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列；ScYHM2基因具有如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述重组巴斯德毕...

【专利技术属性】
技术研发人员：周雍进，蔡鹏，纪璐璐，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：