一种毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法技术

本发明专利技术公开了一种在毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法，包括如下步骤：构建质粒、启动子替换、重组质粒导入菌株中、验证重组质粒表达、信号肽优化、基因敲除、伴侣蛋白共表达、发酵条件优化等。本发明专利技术提供的技术方案有着极高的提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的效果。活的效果。活的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法


[0001]本专利技术涉及蛋白质工程或基因工程
，特别是涉及一种毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法。

技术介绍

[0002]溶菌酶(lysozyme)由于其抗菌性、抗病毒、提高免疫力等特性而作为一种新型抗菌肽受到了广泛关注。与传统的抗生素不同，溶菌酶可以水解细菌细胞壁的β
‑
1，4糖苷键，破坏细胞壁的结构使细菌溶解死亡，因此不必担心耐药性问题。溶菌酶有着良好的杀灭微生物的效果，在畜牧业、食品产业、临床医学等方面广泛应用,也引起世界卫生组织、粮食农业组织的关注。
[0003]溶菌酶又称胞壁质酶(muramidase)或N
‑
乙酰胞壁质聚糖水解酶(N
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acetylmuramide glycanohydrolase)，是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶可分为动物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶，其中动物溶菌酶又分为鸡型溶菌酶(c型溶菌酶)、鹅型(g型)溶菌酶、无脊椎型溶菌酶三种。人源溶菌酶属于c型溶菌酶，由130个氨基酸组成，其相对分子量为14700Da。相比其他类型溶菌酶,人源溶菌酶具有酶活力高、热稳定性高等优点，并且是人体内源蛋白质。而由于原料来源和纯化成本等原因，人源溶菌酶的制备量无法满足各领域的需求。目前存在多种利用真核或原核宿主生产人源溶菌酶的方式，但是在酶活和产量上处于不能让人满意的状态。

技术实现思路

[0004]本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0005]鉴于上述和/或现有提高人源溶菌酶分泌效率及酶活方法中存在的问题，提出了本专利技术。
[0006]因此，本专利技术其中一个目的是，克服现有提高人源溶菌酶分泌效率及酶活方法的不足，提供一种在毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法。
[0007]为解决上述技术问题，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了如下技术方案：一种在毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法，其包括如下步骤：
[0008]优化碱基序列：将毕赤酵母密码子偏好性优化编码的碱基序列人工合成并构建到质粒中，得到重组质粒；
[0009]优化启动子并且优化发酵条件：对于重组质粒中的诱导型启动子更换为组成型启动子，并对两种启动子进行生产强度比较以及发酵条件优化；
[0010]信号肽优化：将hLYZ的分泌信号肽进行优化，验证信号肽优化后的结果；
[0011]敲除基因：敲除VPS10
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1、VPS10
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2中的一个或两个基因形成单敲除或者双敲除菌株；
[0012]共表达伴侣蛋白：将敲除基因完成后的菌株实现伴侣蛋白共表达，并且验证其是否能够稳定并且提高酶活；
[0013]发酵罐水平优化：将完成上述优化的菌株进行5L发酵罐发酵条件探讨，探明最佳发酵条件。
[0014]作为本专利技术所述毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法中的一种优选方案，其中优化碱基序列中，所述毕赤酵母密码子偏好性优化编码的碱基序列为hLYZ。
[0015]作为本专利技术所述毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法中的一种优选方案，其中优化碱基序列中，所述质粒为pPIC9K。
[0016]作为本专利技术所述毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法中的一种优选方案，其中优化碱基序列中，所述启动子的种类包括诱导性启动子和组成型启动子中的一种或一种以上，所述启动子包括P
AOX1
、P
GAP
中的一种或两种。
[0017]作为本专利技术所述毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法中的一种优选方案，其中优化碱基序列中，使用的限制性核酸内切酶为EcoRⅠ和NotⅠ。
[0018]作为本专利技术所述毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法中的一种优选方案，其中优化启动子并且优化发酵条件中，诱导型启动子P
AOX1
发酵生产hLYZ最适的温度为26℃，最适pH为6.0；组成型启动子P
GAP
发酵生产hLYZ的最适温度为28℃，最适pH 6.0。
[0019]作为本专利技术所述毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法中的一种优选方案，其中信号肽优化中，替换掉的信号肽为α信号肽，进行替换的信号肽种类包括HFBI signal sequence(Hss)、INUIA signal sequence(Iss)、W1 signal sequence(Wss)、Killer signal sequence(Kss)、Invertase signal sequence(Inss)、hLYZ signal sequence(hss)、Albumin signal sequence(Alss)、Lipase signal sequence(Lss)、Apre signal sequence(Apss)、Glucoamylase signal sequence(Gss)中的一种。
[0020]作为本专利技术所述毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法中的一种优选方案，其中信号肽优化中，替换信号肽使用的引物为F、R，所述F1、R1包括Iss
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F、Iss
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R、Hss
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F、Hss
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R、Inss
‑
F、Inss
‑
R、Kss
‑
F、Kss
‑
R、Lss
‑
F、Lss
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R、Alss
‑
F、Alss
‑
R、Gss
‑
F、Gss
‑
R、hss
‑
F、hss
‑
R、Wss
‑
F、Wss
‑
R、Apss
‑
F、Apss
‑
R中的一种或一种以上。
[0021]作为本专利技术所述毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法中的一种优选方案，其中共表达伴侣蛋白中，共表达的伴侣蛋白为Sso2、Ero1、Pdi1、Kex2、Aft1、Hac1、Hrd1、Bmh2、Ydj1、Cne1中的一种或几种。
[0022]作为本专利技术所述毕赤酵母中提高人源溶菌酶分泌效率及酶活的方法中的一种优选方案，其中共表达伴侣蛋白中，使用的限制性核酸内切酶为EcoR I和Sal I或者Xho I和Not I。
[0023]本专利技术提供了一种使用插入含有基因偏好性编码的质粒，同时结合启动子、信号肽、伴侣蛋白的优化，得到了一种在分泌效率和酶活上有着突出的良好的效果的人源溶菌酶表达和分泌菌株。
附图说明
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
I和Not I...

【专利技术属性】
技术研发人员：高晓冬，李子杰，王亚森，许向阳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：