用于生产二羧酸的微生物及使用其生产二羧酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种热带假丝酵母细胞系，其包含突变基因，对基质细胞的细胞毒性具有改善的耐受性，并且涉及一种使用热带假丝酵母细胞系生产二羧酸的方法。与现有细胞系相比，根据本发明专利技术开发的生产二羧酸的热带假丝酵母细胞系对现有基质毒性具有改善的耐受性，二羧酸生产效率显著提高，因此可用于二羧酸的生物生产，并且预期具有高的工业实用性。并且预期具有高的工业实用性。并且预期具有高的工业实用性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产二羧酸的微生物及使用其生产二羧酸的方法


[0001]本专利技术涉及包括突变基因的对底物的细胞毒性具有改善的耐受性的微生物，以及使用该微生物生产二羧酸(DCA)的方法。

技术介绍

[0002]二羧酸(Dicarboxylic acid，DCA)是含有两个羧基基团(
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COOH)的有机化合物。二羧酸的分子通式可以用HO2C
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R
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CO2H来表示，其中R可以是脂肪族或芳香族基团。通常，二羧酸表现出类似于单羧酸的化学反应和反应性。二羧酸也用于制备共聚物，例如聚酰胺和聚酯。工业中使用最广泛的二羧酸是己二酸，它是用于生产尼龙的前体。二羧酸的其他例子包括天冬氨酸和谷氨酸，它们是人体中的两种氨基酸。此外，其他羧酸已用于各种工业领域。
[0003]此类二羧酸已通过化学工艺或生物方法制备。作为关于制备二羧酸的一个例子，作为二羧酸之一的癸二酸，即使使用苯酚和甲酚也可以合成它，但已知蓖麻油氧化是最环保且价格最具竞争力的方法。蓖麻油通过蒸汽裂解进行酯交换，并通过酯交换生产蓖麻油酸。将如此产生的蓖麻油酸在250℃下加热后与碱(例如熔融苛性钠等)混合，经苛性碱消化分解为辛醇(2
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辛醇)和癸二酸。将如此产生的产物纯化以得到高纯度癸二酸(美国专利第5,952,517和6,392,074号)。然而，这种方法的缺点是需要在300℃或更高的高温处理下才能达到上述目的，并且使用诸如硫酸的强酸，以及由于使用了诸如重金属、有毒有机溶剂等物质而产生大量的环境污染物。除了使用化学方法制备癸二酸外，还可以通过电解己二酸单乙酯钾(Potassium monoethyl adipate)来进行这种生产。
[0004]在之前的研究中，已经报道了使用ω
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氧化能力优异且β
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氧化被阻断的热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株通过生物方式来生产二羧酸。然而，该方法的局限性在于它不能有效地产生二羧酸，因为热带假丝酵母菌株对表现出细胞毒性的底物的耐受性差(非专利文件1：David L.Craft等人，《应用与环境微生物学》，69(10):5983
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5991,2003)。特别是，韩国专利(专利申请号10
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2015
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0149253)公开了使用一种突变型热带假丝酵母菌株由具有细胞毒性的底物生产癸二酸，但没有关于耐受性增强因子和癸二酸产生途径的研究的报道。因此，开发能够使用生物方法大量生产二羧酸的有用菌株是重要的。
[0005]因此，本专利技术人通过使用产生二羧酸的热带假丝酵母菌株的进化方法筛选了对具有细胞毒性的底物具有增强的耐受性以表现出增强的产生二羧酸的能力的菌株，并鉴定了来自热带假丝酵母菌株的对底物耐受性有影响的基因。因此，基于这些事实完成了本专利技术。
[0006][相关技术文件][0007][专利文件][0008]韩国专利公开特许号10
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2017
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0048763
[0009][非专利文件][0010]David L.Craft等人，《应用与环境微生物学》，69(10)：5983
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5991，2003

技术实现思路

[0011]技术问题
[0012]因此，本专利技术的一个目的是提供一种对底物的细胞毒性具有改善的耐受性的热带假丝酵母菌株，其中该菌株包含在一个或多个选自以下的基因中的突变：由SEQ ID NO：1所示的碱基序列表示的LIP1(脂肪酶)基因、由SEQ ID NO：2所示的碱基序列表示的FAT1(脂肪酸转运)基因以及由SEQ ID NO：3所示的碱基序列表示的MRP1(多药耐药蛋白)基因，或其中该菌株用一个或多个选自以下的突变基因转化：突变的LIP1基因、突变的FAT1基因和突变的MRP1基因。
[0013]本专利技术的另一个方面是提供一种通过将热带假丝酵母菌株与底物一起培养来生产二羧酸的方法。
[0014]技术方案
[0015]为了实现以上目的，本专利技术提供一种对底物的细胞毒性具有改善的耐受性的热带假丝酵母菌株，其中该菌株包含在一个或多个选自以下的基因中的突变：由SEQ ID NO：1所示的碱基序列表示的LIP1(脂肪酶)基因、由SEQ ID NO：2所示的碱基序列表示的FAT1(脂肪酸转运)基因以及由SEQ ID NO：3所示的碱基序列表示的MRP1(多药耐药蛋白)基因，或其中该菌株用一个或多个选自以下的突变基因转化：突变的LIP1基因、突变的FAT1基因和突变的MRP1基因。
[0016]根据一个实施方式，当将正常的热带假丝酵母菌株在含有表现出细胞毒性的底物的培养基中培养以筛选在进化方面在该底物上具有优异存活能力的菌株时，已经通过对所筛选菌株的基因组分析发现，一个或多个选自以下的内源基因发生突变：由SEQ ID NO：1所示的碱基序列表示的LIP1(脂肪酶)基因、由SEQ ID NO：2所示的碱基序列表示的FAT1(脂肪酸转运)基因以及由SEQ ID NO：3所示的碱基序列表示的MRP1(多药耐药蛋白)基因。此外，已经发现，当突变基因被分离并单独转导到正常的热带假丝酵母菌株中时，该热带假丝酵母菌株对表现出细胞毒性的底物具有改善的耐受性。
[0017]由SEQ ID NO：1所示的碱基序列表示的LIP1(脂肪酶)基因的突变基因mtLIP1(脂肪酶)的碱基序列可以如SEQ ID NO：4所示，由SEQ ID NO：2所示的碱基序列表示的FAT1(脂肪酸转运)基因的突变基因mtFAT1(脂肪酸转运)的碱基序列可以如SEQ ID NO：5所示，或者由SEQ ID NO：3所示的碱基序列表示的MRP1(多药耐药蛋白)基因的突变基因mtMRP1(多药耐药蛋白)的碱基序列可以如SEQ ID NO：6所示。
[0018]一个或多个突变基因可以被包括在载体中。载体可以是基因可以可操作连接的形式。在本专利技术中，术语“可操作连接”一般意指将碱基表达调控序列与编码所需蛋白质的碱基序列可操作连接以执行其功能，从而对编码所需蛋白质的碱基序列的表达产生影响。可以使用本领域已知的基因重组技术来实现载体的可操作连接，并且可以使用本领域已知的消化酶和连接酶等进行位点特异性DNA消化和连接。
[0019]在本专利技术中，术语“载体”是指任何用于将碱基克隆和/或转移到宿主细胞中的介质。载体可以是可以与另一个DNA片段结合以复制结合片段的复制子。术语“复制子”是指任何在体内作为DNA复制的自体单位起作用、也就是说可通过其自身调节进行复制的遗传单位(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语“载体”可以包括用于在体外、离体或体内将碱基引入宿主细胞的病毒介质和非病毒介质。此外，术语“载体”可以包括微球形DNA。例
如，载体可以是不具有细菌DNA序列的质粒。术语“载体”还可以包括转座子，例如Sleeping Beauty(Izsvak等人.J.MoI.Biol.302:93
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.对底物的细胞毒性具有改善的耐受性的热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株，其中所述菌株包含在一个或多个选自以下的基因中的突变：由SEQ ID NO：1所示的碱基序列表示的LIP1(脂肪酶)基因、由SEQ ID NO：2所示的碱基序列表示的FAT1(脂肪酸转运)基因以及由SEQ ID NO：3所示的碱基序列表示的MRP1(多药耐药蛋白)基因，或其中所述菌株用一个或多个选自以下的突变基因转化：突变的LIP1基因、突变的FAT1基因和突变的MRP1基因。2.根据权利要求1所述的热带假丝酵母菌株，其中，所述突变的LIP1(脂肪酶)基因如SEQ ID NO：4所示。3.根据权利要求1所述的热带假丝酵母菌株，其中，所述突变的FAT1(脂肪酸转运)基因如SEQ ID NO：5所示。4.根据权利要求1所述的热带假丝酵母菌株，其中，所述突变的MRP1(...

【专利技术属性】
技术研发人员：金京宪，蒂鲁马莱萨米，
申请(专利权)人：高丽大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：