本发明专利技术提供了一种利用重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术的方法通过对pPIC9K载体和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行双酶切、连接，获得天蚕素抗菌肽表达载体；通过将天蚕素抗菌肽表达载体转化至巴斯德毕赤酵母菌并筛选阳性转化子，得到重组巴斯德毕赤酵母；通过对重组巴斯德毕赤酵母进行发酵培养、提取，进而获得天蚕素抗菌肽。本发明专利技术的方法能够大量表达天蚕素抗菌肽，特别适合工业化大规模生产；此外，通过该方法生产的天蚕素抗菌肽的抗菌活性高，应用范围广泛。范围广泛。范围广泛。
【技术实现步骤摘要】
一种利用重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法
[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其是涉及一种利用重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法。
技术介绍
[0002]天蚕素(cecropins)是第一个被发现的动物抗菌肽，1980年由Boman等从天蚕蛹中分离得到。该类多肽抗生素一般含有37
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39个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。
[0003]鉴于抗菌肽在杀菌、抗肿瘤甚至抑制病毒复制等方面具有较大的应用潜力，目前国内外正致力于抗菌肽的基因工程等相关研究工作。公开号为CN101307316A的中国专利申请公开了一种以重组枯草杆菌表达系统表达天蚕素CAD抗菌肽的方法，通过人工合成sumo蛋白酶的表达操纵子、酿酒酵母小分子泛素样蛋白与天蚕素AD的融合蛋白表达操纵子基因，克隆天蚕素AD母体基因枯草杆菌表达载体pNF11，转化重组表达载体pNF11
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CAD，从而使重组枯草杆菌在摇瓶中诱导表达。
[0004]黄亚东等人报道了一种采用PCR技术改造抗菌肽AD基因的方法，将其C末端改造为Asn编码，改造后的抗菌肽Cecropin AD基因克隆到pPICZ
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A载体上，构建成酵母重组分泌型表达载体，转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris受体菌GS115中，采用zerocin抗性标记筛选重组转化子，经摇瓶发酵，浓缩发酵液进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和抑菌活性检测。结果表明，改造后的Cecropin AD基因在巴斯德毕赤酵母中获得了表达。
[0005]然而，上述方法仍存在表达量低、抗菌肽抗菌活性有限等缺陷。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于提供一种利用重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法，该方法方法能够大量表达天蚕素抗菌肽，特别适合工业化大规模生产；此外，通过该方法生产的天蚕素抗菌肽的抗菌活性高，应用范围广泛。
[0007]本专利技术提供一种天蚕素抗菌肽表达载体的构建方法，包括：对pPIC9K载体和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行双酶切、连接，获得天蚕素抗菌肽表达载体。
[0008]具体地，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列如下：5
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agatctcacaaaaaaagtgaggatttttttatttttgtattgacaaaaatgggctcgtgtggtataataaatgtagtgaggtg gatgcgagctccagacaaaggaggaaaacatatgattcagaaacggaaacggacggtcagctttagattggtgttaatgt gcacgctgttatttgttagcctgcctatcacgaaaacgtctgct
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(SEQ ID NO：1)。
[0009]本专利技术对天蚕素抗菌肽基因进行如上改造；结果表明，其能够在巴斯德毕赤酵母中大量表达，且表达的天蚕素抗菌肽的抗菌活性高。
[0010]本专利技术还提供一种天蚕素抗菌肽表达载体，通过上述构建方法构建得到。
[0011]本专利技术还提供一种重组巴斯德毕赤酵母，含有上述天蚕素抗菌肽表达载体。具体地，该重组巴斯德毕赤酵母是通过将天蚕素抗菌肽表达载体转化至巴斯德毕赤酵母菌并筛选阳性转化子得到的。
[0012]本专利技术所述的一种重组巴斯德毕赤酵母Y20210415，已经于2021年4月30日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.22264，建议的分类命名：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。
[0013]本专利技术还提供上述天蚕素抗菌肽表达载体或上述重组巴斯德毕赤酵母在制备天蚕素抗菌肽上的应用。
[0014]特别是，本专利技术还提供一种利用重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法，包括：对上述重组巴斯德毕赤酵母进行发酵培养，获得天蚕素抗菌肽。
[0015]更具体地，本专利技术利用重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法，按照下述步骤进行：
[0016]1)种子培养：通过种子培养基对重组巴斯德毕赤酵母进行扩大培养；其中，种子培养基的组成为：磷酸二氢钾10.0
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12.0g/L、磷酸氢二钾2.0
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2.5g/L、七水硫酸镁9.0
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10.0g/L、硫酸铵10.0
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11.0g/L、氯化钙0.30
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0.35g/L、氯化钠0.8
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1.2g/L、氯化钾0.8
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1.2g/L、葡萄糖25
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35g/L、维生素溶液0.8
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1.2mL/L、微量元素溶液4.0
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4.5mL/L；pH为6.0
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6.2。
[0017]2)发酵培养：对重组巴斯德毕赤酵母进行发酵培养，获得天蚕素抗菌肽。
[0018]采用发酵培养基进行所述发酵培养；其中，发酵培养基的组成为：葡萄糖25
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35g/L、硫酸钙0.8
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1.0g/L、硫酸钾16.0
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17.5g/L、七水硫酸镁16.0
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18.0g/L、氢氧化钾4.0
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4.5g/L、浓磷酸25.0
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28.0mL/L、生物素0.6
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1.2mg/L、泛酸钙18
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22mg/L、维生素B1 14
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16mg/L、肌醇15
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17mg/L、烟酸9
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11mg/L和维生素B6 3
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5mg/L和微量元素溶液4.0
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5.0mL/L。
[0019]进一步地，所述微量元素溶液的组成为：五水硫酸铜5.0
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6.0g/L、碘化钠0.08
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0.10g/L、硫酸锰3.0
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3.5g/L、钼酸钠0.2
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0.4g/L、硼酸0.02
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0.05g/L、氯化钴0.5
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0.6g/L、氯化锌20
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22g/L和七水硫酸亚铁65
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70g/L。
[0020]特别是，在所述发酵培养过程中进行补料，补料方法包括：待发酵培养液的溶氧量开始上升时流加葡萄糖溶液，葡萄糖溶液的流加量为0.15
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0.20L/L发酵培养基，流加时间为12
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16h，溶氧量为15
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25％；其中，葡萄糖溶液的组成为：葡萄糖450
‑...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种天蚕素抗菌肽表达载体的构建方法，其特征在于包括：对pPIC9K载体和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行双酶切、连接，获得天蚕素抗菌肽表达载体；具体地，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列如下：5
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agatctcacaaaaaaagtgaggatttttttatttttgtattgacaaaaatgggctcgtgtggtataataaatgtagtgaggtggatgcgagctccagacaaaggaggaaaacatatgattcagaaacggaaacggacggtcagctttagattggtgttaatgtgcacgctgttatttgttagcctgcctatcacgaaaacgtctgct
‑3’
(SEQ ID NO：1)。2.一种重组巴斯德毕赤酵母Y20210415，保藏编号为CGMCC No.22264，建议的分类命名：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。3.利用权利要求2所述的重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法，其特征在按照下述步骤进行：1)种子培养：通过种子培养基对重组巴斯德毕赤酵母进行扩大培养；其中，种子培养基的组成为：磷酸二氢钾10.0
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12.0g/L、磷酸氢二钾2.0
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2.5g/L、七水硫酸镁9.0
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10.0g/L、硫酸铵10.0
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11.0g/L、氯化钙0.30
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0.35g/L、氯化钠0.8
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1.2g/L、氯化钾0.8
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1.2g/L、葡萄糖25
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35g/L、维生素溶液0.8
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1.2mL/L、微量元素溶液4.0
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4.5mL/L；pH为6.0
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6.2；2)发酵培养：对重组巴斯德毕赤酵母进行发酵培养，获得天蚕素抗菌肽；采用发酵培养基进行所述发酵培养；其中，发酵培养基的组成为：葡萄糖25
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35g/L、硫酸钙0.8
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1.0g/L、硫酸钾16.0
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17.5g/L、七水硫酸镁16.0
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18.0g/L、氢氧化钾4.0
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4.5g/L、浓磷酸25.0
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28.0mL/L、生物素0.6
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1.2mg/L、泛酸钙18
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22mg/L、维生素B1 14
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16mg/L、肌醇15
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17mg/L、烟酸9
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11mg/L和维生素B6 3
【专利技术属性】
技术研发人员：倪斌，黄小星，周依宁，李毅，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：
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