一种能高效表达LL-37多肽的多拷贝重组表达载体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能高效表达LL

【技术实现步骤摘要】
一种能高效表达LL
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37多肽的多拷贝重组表达载体及应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种能高效表达LL
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37多肽的多拷贝重组表达载体及应用。

技术介绍

[0002]LL
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37是一种人源抗菌肽，具有广谱抗菌性，不仅对革兰氏阴性菌有抑制效果，还能抑制革兰氏阳性菌。现在国内的奶业出口上还存在很大问题，因为牛奶的抗生素超标，而且现在抗生素的使用容易导致耐药菌的出现，从而出现“超级细菌”，因此这个问题亟待解决，并且添加到牛奶中的防腐剂超标也导致了牛奶的安全问题。而LL
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37本质属于蛋白质，会在体内分解成基本单元的氨基酸，不产生耐药性，无残留问题，是一种新型的生物防腐剂，有很好的研究前景。
[0003]现在用大肠杆菌来诱导表达LL
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37是比较成熟的原核表达系统，但是大部分为包涵体，需要变性和复性操作，此过程中LL
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37损失严重，大大限制了LL
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37的工业化生产。现有技术公开了利用基因工程技术的方法，通过构建融合了LL
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37编码基因的重组表达载体和重组工程菌来表达LL
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37，但是目前的方法仍然存在发酵耗时较长的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是要提供一种能高效表达LL
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37多肽的多拷贝重组表达载体及应用。本专利技术目的是让重组质粒能够在SMD1168H毕赤酵母中高效表达，从而实现LL
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37在真核系统中的分泌表达，简化工序，提高表达量及避免了大肠杆菌会带来的安全性问题。
[0005]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0006]本专利技术一种能高效表达LL
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37多肽的多拷贝重组表达载体，以PPICZα为基础载体插入目的片段得到重组表达载体，所述的重组表达载体PPICZα载体序列包括信号肽α因子、拷贝的LL
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37序列。
[0007]进一步，所述的能高效表达LL
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37多肽的多拷贝重组表达载体，其特征在于：所述目的片段插入在PPICZα的BgI II和BamH I的限制性酶切位点之间。
[0008]本专利技术所述的重组毕赤酵母，采用以PPICZα为基础载体插入目的片段得到重组表达载体转化毕赤酵母感受态细胞，得到重组毕赤酵母。
[0009]进一步，所述重组毕赤酵母的原始菌株包括毕赤酵母SMD1168H。
[0010]进一步，所述重组毕赤酵母的构建方法包括以下步骤：
[0011]S1：配置培养基：
[0012]YPD的配制：胰蛋白胨、酵母提取物用ddH2O溶解并定容，121℃灭菌20min；使用前再加入115℃灭菌15min葡萄糖溶液，固体则加热后再加琼脂粉；
[0013]YPDS的配制：胰蛋白胨、酵母提取物、山梨醇用ddH2O溶解并定容，将溶液加热后加入琼脂粉，121℃灭菌20min；使用前再加入115℃灭菌15min的葡萄糖溶液；
[0014]山梨醇：山梨醇用ddH2O溶解并定容，过滤除菌或者121℃灭菌20min；
[0015]S2：制备感受态细胞：挑取毕赤酵母单菌落用YPD培养基培养至OD值0.4
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0.6之间，离心加纯净水洗涤后再加纯水涡旋混匀，再离心弃上清，再加灭菌山梨醇混合离心一次，最后加入1ml山梨醇，制备感受态细胞；
[0016]S3：制备重组毕赤酵母：
[0017]重组毕赤酵母：用电击的方法电转化感受态，电击后立即加入1ml冷却的山梨醇吹打混匀；再30℃静置培养两小时后取150
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200ul涂布在含有zeocin的YPDS平板上，倒置培养；剩余的液体静置后加入同体积的YPD培养基，30℃、200rpm培养2h，再分别涂布于YPDS平板上，同上条件培养；
[0018]PCR筛选阳性克隆：将引物与PCR相关试剂混合后分装标记好，将长出来的乳白色菌落用牙签挑取到相应的PCR管中，进行PCR反应，再取跑电泳100v跑到三分之二的位置，将条带明显的菌落点到新的YPD固体培养基上，30℃倒置培养，再将菌落挑到液体YPD培养基中，加入相应体积zeocin溶液到液体培养基，并将液体培养基置于摇床上200rpm，30℃过夜培养，制备得到重组毕赤酵母。
[0019]本专利技术所述重组毕赤酵母的应用，所述重组毕赤酵母具有广谱抑菌性，能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
[0020]本专利技术的有益效果是：
[0021]本专利技术是一种能高效表达LL
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37多肽的多拷贝重组毕赤酵母及应用，与现有技术相比，本专利技术具有如下技术效果：
[0022]1本专利技术提供了一种高效表达LL
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37多肽的多拷贝重组表达载体(PPICZα
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LL
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37)。本专利技术以PPICZα为骨架质粒来构建重组表达载体，所述的重组表达载体PPICZα载体序列包括信号肽α因子、拷贝的LL
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37序列。
[0023]2本专利技术将载体毕赤酵母与人源抗菌肽有机结合，其表达是通过酵母菌利用甲醇诱导产生目标蛋白；利用本专利技术的重组载体转化酵母宿主菌能够有序合成并在α
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信号肽的作用下将目标蛋白分泌到胞外，并且该过程α
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信号肽会自动被切除，同时多次串联重复序列释放为单体LL
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37多肽，产生与人源抗菌肽LL
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37相同功能的结构多肽。
[0024]3经过对比抑菌圈的大小和最小抑菌浓度的测量，检测LL
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37的活性。本专利技术的重组毕赤酵母得到的人源抗菌肽LL
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37具有广谱抗菌性，能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
附图说明
[0025]图1是阳性克隆的重组酵母结果图；
[0026]图2是阳性克隆的多拷贝重组酵母结果图；
[0027]图2中：上面：17、16、15、14、13、12、11、10、Ladder(1KB)、9、8、7、6、5、4、3、2、1下面：Ladder(1KB)、负对照、、正对照、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、空18；
[0028]图3是电转化后PCR扩增结果图；
[0029]图3中：从左到右：第一块板：酵母，22、20、18、17、15、空、ladder、13、12、11、8、7、6、4、3、1、空；第二板：空*2、23、24、25、26、空、28、29、空、酵母、正对照、空、负对照；
[0030]图4是三种酶单酶切验证图的1％琼脂糖核酸电泳图；
[0031]图5是30℃、200rpm工程菌甲醇诱导表达结果图；
[0032]图5中：第一块胶：29号、宿主、marker、LL
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37标准品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能高效表达LL
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37多肽的多拷贝重组表达载体，其特征在于：以PPICZα为骨架质粒来构建重组表达载体，所述的重组表达载体PPICZα载体序列包括信号肽α因子、多拷贝的目的片段LL
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37序列。2.根据权利要求1所述的能高效表达LL
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37多肽的多拷贝重组表达载体，其特征在于：所述目的片段插入在PPICZα的BgI II和BamH I的限制性酶切位点之间。3.一种包含如权利要求1所述多拷贝重组表达载体的重组毕赤酵母，其特征在于：采用以PPICZα为基础载体插入目的片段得到重组表达载体转化毕赤酵母感受态细胞，得到重组毕赤酵母。4.根据权利要求3所述的多拷贝重组表达载体的重组毕赤酵母，其特征在于：所述重组毕赤酵母的原始菌株包括毕赤酵母SMD1168H。5.根据权利要求3所述的多拷贝重组表达载体的重组毕赤酵母，其特征在于：所述重组毕赤酵母的构建方法包括以下步骤：S1：配置培养基：YPD的配制：胰蛋白胨、酵母提取物用ddH2O溶解并定容，121℃灭菌20min；使用前再加入115℃灭菌15min葡萄糖溶液，固体则加热后再加琼脂粉；YPDS的配制：胰蛋白胨、酵母提取物、山梨醇用ddH2O溶解并定容，将溶液加热后加入琼脂粉，121℃灭菌20min；使用前再加入115℃灭菌15min的...

【专利技术属性】
技术研发人员：何建，苟兴华，陶雪菊，何正宇，
申请(专利权)人：成都本珍元药业有限公司，
类型：发明
国别省市：