山核桃原生质体的制备及瞬时转化体系的建立制造技术

本发明专利技术公开山核桃原生质体的制备及瞬时转化体系的建立。使用3.0

【技术实现步骤摘要】
山核桃原生质体的制备及瞬时转化体系的建立


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及山核桃原生质体的制备及瞬时转化体系的建立

技术介绍

[0002]植物原生质体指的是植物细胞通过酶解法或机械的方式去除其细胞壁，使其成为仅有质膜包裹的具有活力的细胞。由于原生质体含有全部的遗传物质，具有全能性，是进行分子、生化和生理研究以及转基因植物的生产基础，促进了多种植物的遗传改良。1982年Klercker首次尝试用机械法从藻类植物中制备了原生质体，但由于原生质体产出效率低，该方法并没有被广泛的使用。自1960年Cooking首次发表了关于植物原生质体的制备方法以来，植物原生质体已广泛应用于多个领域，它通常作为受体细胞，对目的基因进行瞬时转化，进而进行亚细胞定位分析，细胞信号转导、蛋白互作分析以及基因编辑等，是一种快速便捷的技术手段。
[0003]原生质体的分离可采用机械法和酶解法。机械法是指细胞处于高渗溶液环境下，使细胞发生质壁分离，原生质体收缩成球形后，磨碎组织，原生质体会从伤口处释放。该方法适合高度液泡化的细胞中分离出来的原生质体，如胡萝卜、甜菜根组织等。所获得的完整原生质体数量较少，但其可以避免酶制剂对于原生质体带来的不可逆伤害，从而影响进一步实验的进行。自1960年Cooking首次采用真菌培养物中的纤维素酶对番茄幼苗根尖进行解离获得大量原生质体以来，几乎所有原生质体的解离工作都是通过酶解法进行的。常用的细胞壁降解酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等。通过该方法可以获得大量的原生质体，但由于酶制剂中含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质，从而会对原生质体的活力产生一定的影响。目前，已从模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)，烟草(Nicotiana tabacum L.)，玉米(Zea maysL.)，水稻(Oryza sativaL.)和其他非模式植物柳枝稷(Panicum virgatum L.)，甘蓝(Brassica oleracea L.)，柑橘(Citrus reticulata Blanco)，黄瓜(Cucumis sativus L.)成功分离出原生质体。
[0004]临安山核桃(Carya cathayensis Sarg.)作为落叶乔木，属胡桃科山核桃，是我国特有的木本油料树种，也是重要的经济林木之一，其果实富含较高的营养价值，主要产于于浙、皖交界的天目山脉，是当地农民经济收入的重要来源。美国山核桃(Carya illinoinensis)，又名薄壳山核桃、长山核桃，作为高大乔木，属胡桃科山核桃。其原产于美国，除此之外在中国、法国、墨西哥、意大利等国家皆有引种应用。作为多年生木本植物，因其结果周期较长，雄花发育会消耗树体大量的营养等生理特性，极大的限制了山核桃产业的发展，对其进行快速繁育、改良、育种是一研究热点。
[0005]目前，山核桃中瞬时转化体系以及蛋白亚细胞定位的研究体系并不成熟，通过瞬时转化技术可以实现短时间内将目标基因表达于受体细胞中，为后续山核桃中基因
‑
蛋白质研究提供一种快捷有效的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的是解决山核桃基因在其他植物中异源表达的技术问题，提供一种山核桃原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法，为后续山核桃中基因
‑
蛋白质研究提供一种快捷有效的方法。
[0007]一种临安山核桃原生质体的制备方法，包括以下步骤：
[0008]步骤(1)、选择生长状态良好，黄色新鲜脆嫩的临安山核桃愈伤组织磨碎；
[0009]作为优选，临安山核桃愈伤组织采用在继代后的7d内。
[0010]步骤(2)、将研磨好的临安山核桃愈伤组织置于酶解液中，25℃避光条件，在50～65rpm/min的摇床上酶解4.5～5.5h；
[0011]所述酶解液包括以下组分：Cellulase R10纤维素酶R103
‑
3.5％(wt/vol)、Macerozyme R10离析酶R100.7
‑
1％(wt/vol)、Driselase崩溃酶(From Basidiomycetes sp)0.3
‑
0.5％(wt/vol)、D
‑
甘露醇0.4M、KCl 40mM、MES(PH 5.7)40mM、CaCl210 mM、BSA0.1％(wt/vol)；
[0012]步骤(3)、酶解产物过滤，滤液低速离心取沉淀；在沉淀中加入预冷W5溶液轻柔洗涤沉淀，终止酶解，低速离心取沉淀，重复2次，将酶解液去除干净；
[0013]作为优选，预冷W5溶液与沉淀的体积比为2:1；
[0014]步骤(4)、在沉淀中再次加入预冷W5溶液轻柔洗涤沉淀，冰浴30min后低速离心取沉淀；用MMG溶液重悬，获得纯化后的原生质体。
[0015]作为优选，预冷W5溶液与沉淀的体积比为1:1；
[0016]所述W5溶液包括以下组分：NaCl 154mM、CaCl2125 mM、KCl 5mM、MES 2mM；
[0017]所述MMG溶液包括以下组分：D
‑
甘露醇0.4mM、MgCl215 mM、MES4mM。
[0018]本专利技术的第二目的是提供PEG
‑
Ca
2+
介导临安山核桃原生质体瞬时转化方法，包括以下步骤：
[0019]步骤(1)、将待转化的外源基因DNA(浓度为3000ng/ul)、100ul用MMG溶液重悬后的原生质体、PEG
‑
Ca2+溶液轻柔混匀，25℃避光条件20
‑
25min，得的孵育转化后混合物；外源基因DNA与原生质体的质量体积比为5
‑
15μg：100ul；PEG
‑
Ca2+溶液与外源基因DNA和原生质体总量的体积比为1:1；
[0020]所述PEG
‑
Ca
2+
溶液包括D
‑
甘露醇0.5M、CaCl21 M、PEG4000 40％(wt/vol)；
[0021]步骤(2)、孵育转化后混合物加入等体积W5溶液，终止转化，低速离心取沉淀；
[0022]步骤(3)、沉淀中加入1000ul W5溶液，轻柔混匀，25℃避光条件培养过夜。
[0023]本专利技术的第三个目的是提供一种美国山核桃原生质体的制备方法，包括以下步骤：
[0024]步骤(1)、选择生长状态良好的美国山核桃愈伤组织，用洁净的手术刀将其切碎；
[0025]步骤(2)、将切碎的美国山核桃愈伤组织置于酶解液中，25℃避光条件，在65rpm/min的摇床上酶解4～4.5h；
[0026]所述的酶解液包括以下组分：纤维素酶RS 1.0
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1.5％(wt/vol)、离析酶R10 0.7
‑
1.0％(wt/vol)、果胶酶0.5
‑
0.8％(wt本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
125mM、KCl 5mM、MES 2mM；所述MMG溶液包括以下组分：D
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甘露醇0.4mM、MgCl2 15mM、MES 4mM。10.PEG
‑
Ca
2+
介导美国山核桃原生质体瞬时转化方法，包括以下步骤：步骤(1)、将待转化的外源基因质粒DNA、用MMG溶液重悬后的权利要求8或9所述的方法制备得到的美国山核桃原生质体、PEG
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【专利技术属性】
技术研发人员：沈锦波，易芳，胡帅，高燕丽，张启香，黄坚钦，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：