一种适用于拟南芥叶片组织原生质体分离的含转录抑制剂的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种转录抑制剂，所述转录抑制剂包含茴香霉素、雷公藤内酯和BMH

【技术实现步骤摘要】
一种适用于拟南芥叶片组织原生质体分离的含转录抑制剂的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种酶解及转录抑制技术，具体涉及一种适用于拟南芥叶片组织的含转录抑制剂的试剂盒，及其在单细胞转录组测序中的应用。

技术介绍

[0002]单细胞测序技术通过解析单个细胞转录组，来构建组织的细胞相互作用网络，是生命科学研究的基础技术手段，用以揭示组织或器官中细胞的多样性和复杂性，解答细胞异质性问题。在植物研究中，由于细胞壁等因素限制，植物组织需要解离为原生质体才能开展单细胞测序，而植物细胞在解离过程中会由于机械离心、温度改变、失去细胞壁支撑等因素，引起转录组在解离过程中发生较大变化，从而造成“解离偏好”，结果的真实性和准确性受到很大影响。
[0003]目前在动物组织解离过程中，可以通过在酶解液中添加转录抑制剂来消除“解离偏好”，保证结果真实、准确、可靠，如《Single Cell Sequencing Reveals Glial Specific Responses to Tissue Processing&Enzymatic Dissociation in Mice and Humans》一文对该方案进行了检验，证明这一方法可以消除人为偏好，增强实验结果的真实性和准确性。但添加转录抑制剂的方法目前尚未在植物组织中得到应用和验证，亟需开发一种适用于植物组织原生质体单细胞测序的转录抑制剂操作方法和流程。

技术实现思路

[0004]现有技术中只有针对动物细胞进行转录抑制的方法，虽然植物和动物都是生物组织，但在物种生理特性、理化特性上都有极大的差异，适用于动物细胞的方法并不能简单适用于植物原生质体。为了解决现有技术存在的不足，本专利技术在大量深入研究和实验的基础上，提供了一种适用于拟南芥叶片组织原生质体分离的含转录抑制剂的试剂盒，并在单细胞测序中予以应用。
[0005]本专利技术提供了一种转录抑制剂，所述转录抑制剂包含茴香霉素、雷公藤内酯和BMH
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21。
[0006]其中，所述转录抑制剂的配方为：15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH
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21；优选地，所述转录抑制剂的配方为：15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH
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21。
[0007]本专利技术还提供了一种含转录抑制剂的酶解液，其包含酶解液和如上所述的转录抑制剂。
[0008]其中，在所述茴香霉素终浓度为15～20μg/mL、雷公藤内酯终浓度为5～7.5μM、BMH
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21终浓度为5～7μM的条件下，每1mL酶解液中添加茴香霉素量为1.5～2.0μL、雷公藤内酯量为1.8～2.8μL、BMH
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21量为1.8～2.6μL。
[0009]其中，所述含转录抑制剂的酶解液的配方为：0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、
0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.45～0.55M甘露醇、0.1～1％果胶酶、15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH
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21；优选地，所述含转录抑制剂的酶解液的配方为：0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶、15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH
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21。
[0010]本专利技术还提供了一种含转录抑制剂的试剂盒，所述试剂盒包括含转录抑制剂的酶解液，含转录抑制剂的W5缓冲液和含转录抑制剂的W1缓冲液。
[0011]其中，在所述茴香霉素终浓度为15～20μg/mL、雷公藤内酯终浓度为5～7.5μM、BMH
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21终浓度为5～7μM的条件下，每1mL的W5分别及WI分别中添加茴香霉素量分别为1.5～2.0μL、雷公藤内酯的量分别为1.8～2.8μL、BMH
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21的量分别为1.8～2.6μL。
[0012]其中，所述含转录抑制剂的酶解液的配方为：0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.45～0.55M甘露醇、0.1～1％果胶酶、15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH
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21；优选地，所述含转录抑制剂的酶解液的配方为：0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶、15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH
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21。
[0013]其中，所述含转录抑制剂的W5缓冲液的配方为：0.15M NaCl、0.12M KCl、5mM CaCl2、2mM MES、15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH
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21；优选地，所述含转录抑制剂的W5缓冲液的配方为：0.15M NaCl、0.12M KCl、5mM CaCl2、2mM MES、15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH
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21。
[0014]其中，所述含转录抑制剂的W1缓冲液的配方为：4mM MES、20mM KCl、0.5M甘露醇、15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH
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21；优选地，所述含转录抑制剂的W1缓冲液的配方为：4mM MES、20mM KCl、0.5M甘露醇、15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH
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21。
[0015]本专利技术还提供了所述转录抑制剂或含转录抑制剂的酶解液或含转录抑制剂的试剂盒在酶解拟南芥叶片组织中的应用。
[0016]本专利技术还提供了所述转录抑制剂或含转录抑制剂的酶解液或含转录抑制剂的试剂盒在单细胞转录组测序中的应用。
[0017]本专利技术还提供了一种利用上述试剂盒酶解拟南芥细胞的方法，包括如下具体步骤：
[0018]步骤(1)、准备试剂：配制含转录抑制剂的酶解液、含转录抑制剂的W5缓冲液、含转录抑制剂的WI缓冲液；
[0019]步骤(2)、制备解离样品：选取拟南芥幼苗茎生叶，剪下洗净、切成碎块；
[0020]步骤(3)、组织酶解：向所述步骤(2)中获得的碎片中加入所述的含转录抑制剂的酶解液，静置、混匀、消化酶解；
[0021]步骤(4)、消化液浑浊后在显微镜下镜检，估算原生质体得率；
[0022]步骤(5)、消化液过筛：先用含转录抑制剂的W5缓冲液润洗组装于离心管上的筛网；然后向所述步骤(4)的消化液中加入所述含转录抑制剂的W5缓冲液，吸取上清过筛；
[0023]步骤(6)、原生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转录抑制剂，其特征在于，所述转录抑制剂包含茴香霉素、雷公藤内酯和BMH
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21。2.如权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，所述转录抑制剂的组成及配方为：15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH
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21。3.一种含转录抑制剂的酶解液，其特征在于，其包含酶解液和如权利要求1所述的转录抑制剂。4.如权利要求3所述的含转录抑制剂的酶解液，其特征在于，在所述茴香霉素终浓度为15～20μg/mL、雷公藤内酯终浓度为5～7.5μM、BMH
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21终浓度为5～7μM的条件下，每1mL酶解液中添加茴香霉素的量为1.5～2.0μL、雷公藤内酯的量为1.8～2.8μL、BMH
‑
21的量为1.8～2.6μL。5.如权利要求3所述的含转录抑制剂的酶解液，其特征在于，所述含转录抑制剂的酶解液的组成及配方为：0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.45～0.55M甘露醇、0.1～1％果胶酶、15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH
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21。6.一种含转录抑制剂的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含转录抑制剂的W5缓冲液、含转录抑制剂的WI缓冲液、如权利要求3所述的含转录抑制剂的酶解液。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在所述茴香霉素终浓度为15～20μg/mL、雷公藤内酯终浓度为5～7.5μM、BMH
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21终浓度为5～7μM的条件下，每1mL的W5缓冲液及WI缓冲液中添加茴香霉素量分别为1.5～2.0μL、雷公藤内酯量分别为1.8～2.8μL、BMH
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21量分别为1.8～2.6μL。8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述含转录抑制剂的酶解液的配方为：0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.45～0.55M甘露醇、0.1～1％果胶酶、15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH
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21；和/或，所述含转录抑制剂的W5缓冲液的配方为：0.15M NaCl、0.12M KCl、5mM CaCl2、2mM MES、15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH
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21；和/或，所述含转录抑制剂的WI缓冲液的配方为：4mM MES、20mM KCl、0.5M甘露醇、15～...

【专利技术属性】
技术研发人员：王佳琦，殷昊，朱燕敏，刘宇华，佟思雨，王树伟，肖云平，
申请(专利权)人：上海欧易生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：