一种基于MALDI-TOF的产气荚膜梭菌鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于MALDI

【技术实现步骤摘要】
一种基于MALDI
‑
TOF的产气荚膜梭菌鉴定方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其是一种基于MALDI
‑
TOF的产气荚膜梭菌鉴定方法。

技术介绍

[0002]产气荚膜梭菌是一种重要的致病菌，在我国，生的肉制品、水产品中存在较严重的产气荚膜梭菌污染。因此，快速准确的鉴定方法对于产气荚膜梭菌的日常检测具有重要意义。
[0003]目前常见的食品中产气荚膜梭菌的检测方法普遍使用传统常规培养生理生化检测方法，此方法存在不少弊端。传统常规培养生理生化法，即利用微生物的形态及常规生理生化特性进行检测，通常是包括微生物形态学以及培养特性的评价。其无特殊设备要求，并且方法经典可靠，具有准确、直观、稳定性好且假阳性低的优点。但检测周期长，费时费力，且存在漏检率，很难满足市场快速准确的检测需求。基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱是近年来发展的一种新型的分析技术，具有操作简单、快速、谱图直观、能耐受一定浓度的盐和去垢剂等特点，可针对蛋白质组与生物标志物进行更高灵敏、高精度、高分辨率的快速分析研究，实现对未知微生物的快速鉴定、分型、溯源等。
[0004]目前，在科研和实际应用上，均亟需将基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱应用到食品中产气荚膜梭菌的鉴定中，开发出食品中产气荚膜梭菌的快速检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是提供一种基于MALDI
‑
TOF的产气荚膜梭菌鉴定方法，实现食品中产气荚膜梭菌的快速检测。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案如下。
[0007]一种基于MALDI
‑
TOF的产气荚膜梭菌鉴定方法，包括以下步骤：
[0008]A、取产气荚膜梭菌一代新鲜培养物划线接种于PCA平板，制备产气荚膜梭菌标准样品；
[0009]B、使用甲酸萃取法处理产气荚膜梭菌样品，获取菌株样品蛋白，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱获得样品的质谱图，选取特定峰值范围的质谱峰作为特征峰；
[0010]C、使用甲酸萃取法处理产气荚膜梭菌样品，获取菌株样品蛋白，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱获得样品的质谱图，针对步骤B中选取的特征峰进行二级质谱检测，得到鉴定结果。
[0011]作为优选，步骤A中，培养温度为36℃，培养时间为24h。
[0012]作为优选，步骤B中，具体包括以下步骤，
[0013]B11、样品前处理，挑取产气荚膜梭菌标准样品，转移至2mL离心管中，加入300μL灭菌水，充分振荡均匀后，加入900μL无水乙醇，涡旋至少一分钟，放入离心机，设置转速为13000rpm，离心时间2min，重复2次，离心后，倒掉上清液，保留取沉淀；
[0014]B12、样品靶板制作，向标准样品沉淀加入50μL 70％甲酸振荡2 min，然后加入50μL乙腈再次振荡2min，放入离心机，设置转速为13000rpm，离心时间2min，保留上清，取1μL加到基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱靶板上，待溶液挥发干后，加1μL基质，等质谱靶板完全干燥；
[0015]B13、质谱校准，将用于质谱对照的标准大肠杆菌划线接种于PCA 平板，每次检测样品使用标准大肠杆菌的11个特征峰进行校准；
[0016]B14、筛选特征峰，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行鉴定，每个样品需独立检测3次，3次检测均反馈检测结果，从中挑选产气荚膜梭菌的特征峰。
[0017]作为优选，步骤B中，具体包括以下步骤，
[0018]B21、向装有HCCA的旋盖存液管中添加250μL标准溶剂，标准溶剂含有乙腈50％、水47.5％、三氟乙酸2.5％，振摇并涡旋使HCCA 完全溶解，得到浓度为10mgHCCA/mL的基质溶液；
[0019]B22、向装有BTS的管中加入50μL标准溶剂，用移液枪反复吹打至少20次使其完全溶解；
[0020]B23、室温下放置BTS溶液5分钟，然后上下吹打混合至少20次；
[0021]B24、在室温下离心，离心时间为2min，离线转速为13000rpm，留取上清液；
[0022]B25、将1μL BTS溶液放置在MALDI靶板上定义为验证的靶位，室温下晾干；
[0023]B26、将1μL HCCA基质溶液仔细涂敷在样本上，室温下晾干；
[0024]B27、在MALDI靶板上选取合适的靶位，将1μL产气荚膜梭菌靶板样品溶液放置在靶位上，室温下晾干；
[0025]B28、将1μL HCCA基质溶液仔细涂敷在待测的产气荚膜梭菌样品上，室温下晾干；
[0026]B29、使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行检测，得到产气荚膜梭菌的质谱图；根据质谱图，选出产气荚膜梭菌的特征峰。
[0027]作为优选，步骤C中，具体包括以下步骤，
[0028]C11、样品前处理，挑取产气荚膜梭菌标准样品，转移至2mL离心管中，加入300μL灭菌水，充分振荡均匀后，加入900μL无水乙醇，涡旋至少一分钟，放入离心机，设置转速为13000rpm，离心时间2min，重复2次，离心后，倒掉上清液，保留取沉淀；
[0029]C12、样品靶板制作，向标准样品沉淀加入50μL 70％甲酸振荡2 min，然后加入50μL乙腈再次振荡2min，放入离心机，设置转速为13000rpm，离心时间2min，保留上清，取1μL加到飞行质谱靶板上，待溶液挥发干后，加1μL基质，等质谱靶板完全干燥；
[0030]C13、质谱校准，将标准大肠杆菌划线接种于PCA平板，每次检测样品使用标准大肠杆菌的11个特征峰进行校准；
[0031]C14、鉴定，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱，针对步骤B14筛选出的产气荚膜梭菌特征峰进行二级质谱检测，通过观察谱图中的谱峰进行鉴定。
[0032]作为优选，步骤C中，具体包括以下步骤，
[0033]C21、在MALDI靶板上选取合适的靶位，将1μL产气荚膜梭菌靶板样品溶液放置在靶位上，室温下晾干；
[0034]C22、将1μL HCCA基质溶液仔细涂敷在待测的产气荚膜梭菌样品上，室温下晾干；
[0035]C23、使用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱对筛选出的特征峰进行二级
质谱检测；
[0036]C24、将产气荚膜梭菌特征峰下的二级质谱图进行对比，通过观察谱峰的特异性进行鉴定。
[0037]采用上述技术方案所带来的有益效果在于：本专利技术结合基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱技术的精准分析，开发出了食品中产气荚膜梭菌的方法，为食品中产气荚膜梭菌的精准检测控制提供了必要的技术保障，也为基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱技术在其它污染菌和致病菌的检测方法的推广奠定了基础。
[0038]本专利技术根据产气荚膜梭菌的特征峰进行筛选，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱快速鉴定产气荚膜梭菌，通过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于MALDI
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TOF的产气荚膜梭菌鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：A、取产气荚膜梭菌一代新鲜培养物划线接种于 PCA 平板，制备产气荚膜梭菌标准样品；B、使用甲酸萃取法处理产气荚膜梭菌样品，获取菌株样品蛋白，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱获得样品的质谱图，选取特定峰值范围的质谱峰作为特征峰；C、使用甲酸萃取法处理产气荚膜梭菌样品，获取菌株样品蛋白，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱获得样品的质谱图，针对步骤B中选取的特征峰进行二级质谱检测，得到鉴定结果。2.根据权利要求1所述的基于MALDI
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TOF的产气荚膜梭菌鉴定方法，其特征在于：步骤A中，培养温度为36℃，培养时间为24h。3.根据权利要求1所述的基于MALDI
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TOF的产气荚膜梭菌鉴定方法，其特征在于：步骤B中，具体包括以下步骤，B11、样品前处理，挑取产气荚膜梭菌标准样品，转移至2 mL离心管中，加入300 μL灭菌水，充分振荡均匀后，加入900 μL无水乙醇，涡旋至少一分钟，放入离心机，设置转速为13000rpm，离心时间2 min，重复2次，离心后，倒掉上清液，保留取沉淀；B12、样品靶板制作，向标准样品沉淀加入50μL 70%甲酸振荡2 min，然后加入50 μL乙腈再次振荡2 min，放入离心机，设置转速为13000 rpm，离心时间2 min，保留上清，取1μL加到基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱靶板上，待溶液挥发干后，加1 μL基质，等质谱靶板完全干燥；B13、质谱校准，将用于质谱对照的标准大肠杆菌划线接种于 PCA 平板，每次检测样品使用标准大肠杆菌的11个特征峰进行校准；质谱对照菌株的标准菌株为大肠杆菌ATCC8739；B14、筛选特征峰，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行鉴定，每个样品需独立检测3次，3次检测均反馈检测结果，从中挑选产气荚膜梭菌的特征峰。4.根据权利要求1所述的基于MALDI
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TOF的产气荚膜梭菌鉴定方法，其特征在于：步骤B中，具体包括以下步骤，B21、向装有HCCA的旋盖存液管中添加250μL标准溶剂，标准溶剂含有乙腈50%、水47.5%、三氟乙酸2.5%，振摇并涡旋使HCCA完全溶解，得到浓度为10mgHCCA/mL的基质溶液；B22、向装有BTS的管中加入50μL标准溶剂，用移液枪...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈佳，
申请(专利权)人：石家庄学院，
类型：发明
国别省市：