一种HEK-293细胞无血清和悬浮培养的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种HEK

【技术实现步骤摘要】
一种HEK
‑
293细胞无血清和悬浮培养的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种HEK
‑
293细胞无血清和悬浮培养的制备方法，所述制备方法获得的细胞系及其应用。

技术介绍

[0002]HEK 293细胞系，又称hek293、293细胞，是1973年产生的人胚肾293细胞。顾名思义，它们是一种典型的细胞系，起源于人体胚胎肾细胞，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，具有转染效率高，易于培养等特点，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。
[0003]HEK 293细胞系可用于多种研究。例如，它可用于研究药物对钠通道的影响、可确定的RNA干扰系统和蛋白质中的核输出信号等。更具体地说，HEK 293细胞被用于腺病毒载体的繁殖。利用病毒进化目标基因并将其转移到细胞中是一种有效的方法。然而，由于病毒作为病原体的特性，它们也会带来风险。因此，为了繁殖这种病毒载体，需要一种能够表达缺失基因的细胞系。由于HEK293细胞含有许多腺病毒基因，因此利用它们来传播这些基因所在的腺病毒载体是非常理想的。
[0004]单层贴壁培养293细胞，一般使用一定浓度的胎牛血清(FBS)，FBS不仅价格昂贵，而且有污染外源微生物和致病因子的风险，使得质量难以控制，且产量有限，难以实现规模化生产。因此采用无血清全悬浮工艺优势明显。因此高效驯化无血清、悬浮培养型293细胞株是目前最关键的技术瓶颈之一，建立和鉴定无血清、悬浮生长并且产毒能力高的293细胞株是一项很有意义的工作。

技术实现思路

[0005]为实现上述目的，本专利技术提供下述技术方案：
[0006]本专利技术第一方面，提供一种HEK
‑
293细胞的无血清和悬浮培养的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)、无血清驯化；和(2)、悬浮驯化。
[0007]优选的，所述步骤(1)包括a、HEK
‑
293细胞复苏；b、HEK
‑
293细胞在血清浓度梯度递减的悬浮培养基中培养；c、HEK
‑
293细胞在低浓度血清的悬浮培养基中培养，获得适合低血清浓度培养的细胞。
[0008]更优选的，所述步骤(1)b中的血清的起始浓度为8
‑
12％(体积)，进一步优选的，所述血清浓度梯度递减的数值为2
‑
5％(体积)。每次递减的数值可以是2
‑
5％(体积)中的任一数值，例如2％，2.25％，2.5％，2.75％，3％，3.25％，3.5％，3.75％，4％，4.25％，4.5％，4.75％，5％等等。每次递减的数值可以相同或者不同。例如第一血清浓度为10％(体积)，第二血清浓度为5％(体积)，第三血清浓度为2％(体积)，或者，又例如第一血清浓度为12％(体积)，第二血清浓度为7％(体积)，第三血清浓度为3％(体积)。又例如，第一血清浓度为8％(体积)，第二血清浓度为5％(体积)，第三血清浓度为2.5％(体积)。
[0009]更优选的，所述步骤(1)c中低血清浓度为血清浓度不超过2.5％，例如，可以是2.5％，2.0％等。
[0010]更优选的，所述步骤(1)(c)包括在血清浓度梯度递减的悬浮培养基中培养，所述的浓度梯度递减为血清浓度逐渐降低，至接近于0％。例如，2.0％，1％，0.5％，0.2％依次递减，又如，2％，1.5％，1.0％，0.5％依次递减，或者2.5％，2％，1.3％，0.7％，0.15％依次递减，或者其他类似的浓度的递减方式。
[0011]更优选的，所述步骤(2)包括将步骤(1)获得的细胞在无血清培养基中悬浮驯化。
[0012]进一步优选的，所述步骤(2)包括a、将细胞在无血清培养基中培养，利用外力使细胞悬浮；b、筛选悬浮细胞，摇床培养，获得HEK
‑
293XS细胞系。
[0013]更优选的，所述基础培养基包括但不仅限于：DMEM等等。
[0014]更优选的，所述悬浮培养基包括但不仅限于：FreeStryle
TM 293培养基等等。
[0015]优选的，所述制备方法还包括步骤(3)、细胞冻存。
[0016]更优选的，所述步骤(3)包括：a、离心，收集驯化后的细胞，用冻存液将细胞沉淀密度调整为0.5
×
107～1.5
×
107个/ml；b、将冻存管放于程序降温盒中于
‑
80
±
5℃中预冻24～72h后，转入液氮中保存。
[0017]在一个优选的实施方式中，所述制备方法包括：
[0018](1)、无血清驯化：
[0019]a、HEK
‑
293细胞复苏：取冻存的HEK
‑
293细胞水浴融化，置于含有10％血清中的DMEM溶液中培养；
[0020]b、HEK
‑
293细胞在血清浓度梯度递减的悬浮培养基中培养：血清浓度依次为5％，2％，当细胞融合度为75％
‑
85％时，更换血清浓度递减的培养基。优选的，如有悬浮细胞，观察悬浮细胞的活力，悬浮细胞活率不低于60％时，离心，去上清并与Tryple消化的贴壁细胞混合，继续培养。
[0021]c、HEK
‑
293细胞在低浓度血清，并且血清浓度梯度递减的悬浮培养基中培养，获得适合低血清浓度培养的细胞：所述血清浓度依次为2.0％，1％，0.5％，0.2％，当细胞融合度为75％
‑
85％时，更换血清浓度递减的培养基。优选的，如有悬浮细胞，观察悬浮细胞的活力，悬浮细胞活率不低于60％时，离心，去上清并与Tryple消化的贴壁细胞混合，继续培养。
[0022](2)悬浮驯化：
[0023]a、将(1)驯化后细胞在无血清培养基中培养，利用外力使细胞悬浮：在无血清培养基中培养，当细胞融合度为75％
‑
85％时，用外力轻拍培养器皿让细胞悬浮。
[0024]b、筛选悬浮细胞，摇床培养，获得HEK
‑
293XS细胞系：将悬浮细胞在无血清悬浮培养基中培养，每2～3天用无血清悬浮培养基细胞密度调整为6
×
105～8
×
105个细胞/ml，6～8天后转至更大体积的培养器皿中，每2～3天用无血清悬浮培养基细胞密度调整为6
×
105～8
×
105个细胞/ml，并在转速逐渐提高的方式下培养，每个转速下维持3～7天生长时间，当细胞生长至2.4
×
106～3.2
×
106个细胞/ml时，用无血清悬浮培养基细胞密度调整为6
×
105～8
×
105个细胞/ml，转至更大体积的培养器皿中，摇床上培养，体积保持200～400ml，生长2～3天密度达到3
×
106～10
×
1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种HEK
‑
293细胞的无血清和悬浮培养的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)、无血清驯化；和(2)、悬浮驯化。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括a、HEK
‑
293细胞复苏；b、将HEK
‑
293细胞在血清浓度梯度递减的悬浮培养基中培养；c、将HEK
‑
293细胞在低浓度血清的悬浮培养基中培养获得适合低血清浓度培养的细胞。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)b中血清的起始浓度为8
‑
12％(体积)，优选的，所述血清浓度梯度递减的数值为2
‑
5％(体积)。4.如权利要求2
‑
3任一所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)c中低血清浓度为血清浓度不超过2.5％。5.如权利要求2

【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀莲，
申请(专利权)人：宜明北京细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：