高通量鉴定病原菌与宿主分子之间的相互作用的方法技术

本发明专利技术涉及病原菌鉴定技术领域，且公开了一种高通量鉴定病原菌与宿主分子之间的相互作用的方法，利用宿主细胞的模式识别受体和宿主免疫系统中的一些关键受体信号和传导分子等基因，敲除宿主信息分子分离出巨噬细胞，使用含有报告基因质粒的病原菌感染经过基因组RNA干扰转染的巨噬细胞，进一步利用基因敲除宿主信息分子获得感染模型，检测分析宿主感染病原菌后的存活变化及功能。通过研究病原菌蛋白和宿主蛋白相互作用网络，非编码RNA和蛋白相互作用，重点发现和研究新的病原菌因子和宿主因子，新的调控机制，确定侵入和存活缺陷突变株，高通量地分析菌体分泌蛋白在宿主细胞中的诱导表达。的诱导表达。的诱导表达。

【技术实现步骤摘要】
高通量鉴定病原菌与宿主分子之间的相互作用的方法


[0001]本专利技术涉及病原菌鉴定
，具体为一种高通量鉴定病原菌与宿主分子之间的相互作用的方法。

技术介绍

[0002]病原菌能产生致病物质，造成宿主感染，正常菌群与宿主处于生态平衡状态，它们并不引起机体的感染，故属于非病原菌范畴，在特定条件下，因为菌群失调、宿主免疫功能低下或菌群寄居部位改变造成了生态失调状态，正常菌群也能引起感染，病原菌的感染性和致病力是病原菌－宿主免疫系统间相互作用的结果，现有的病原菌与宿主分子之间的相互作用的检测方法的筛选效率低，同时容易产生操作误差。

技术实现思路

[0003](一)解决的技术问题
[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种高通量鉴定病原菌与宿主分子之间的相互作用的方法，具备高通量地分析菌体分泌蛋白在宿主细胞中的诱导表达地等优点，解决了检测的筛选效率低，同时容易产生操作误差的问题。
[0005](二)技术方案
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种高通量鉴定病原菌与宿主分子之间的相互作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007]S1、通过利用宿主细胞的模式识别受体和宿主免疫系统中的一些关键受体信号和传导分子等基因，敲除宿主信息分子分离出巨噬细胞；
[0008]S2、挑选S1中获得的巨噬细胞感染病原菌，使用含有报告基因质粒的病原菌感染经过基因组RNA干扰转染的巨噬细胞，选择3
‑
6个巨噬细胞表面细胞受体，通过RNA干扰或基因敲除后研究其病原菌在侵入和在细胞内存活的作用机制；
[0009]S3、进一步利用基因敲除宿主信息分子获得感染模型，检测分析宿主感染病原菌后的存活、细胞因子和免疫细胞亚群数量的变化及功能；
[0010]S4、将针对在宿主细胞内特异表达的靶蛋白的编码基因采用敲除、互补等遗传分析方法，构建相应的基因工程菌株，通过质粒转染表达在相关的细胞模型和动物模型中，进一步鉴定和确认靶蛋白与病原菌的胞内生存是否相关；
[0011]S5、采用RNA干扰和抗体干扰等技术，阐明宿主细胞蛋白在病原菌感染中的应答及信号路调控机制，利用荧光标记、免疫组化以及细胞实时成像等技术，研究病原菌在细胞内所分泌蛋白的定向运输和分布定位。
[0012]优选的，宿主细胞的模式识别受体为TLR4,TLR7和TLR9等，所述受体信号传导分子为SHP
‑
1，SHP
‑
2,IL
‑
17,MKP
‑
5,β
‑
arrestin1,β
‑
arrestin2等。
[0013]优选的，S2中的检测方法为RNA干扰，抗体封闭，Westernblot和酵母双杂交等。
[0014]优选的，转染后的巨噬细胞等待0.5h至6h后通过荧光扫描，报告基因分析或细菌
培养和计数分析侵入巨噬细胞中的病原菌及在巨噬细胞中存活的病原菌数量。
[0015]优选的，病原菌为结核分枝杆菌H37Rv，宿主为实验宿主。
[0016](三)有益效果
[0017]与现有技术相比，本专利技术提供了一种高通量鉴定病原菌与宿主分子之间的相互作用的方法，具备以下有益效果：
[0018]1、该高通量鉴定病原菌与宿主分子之间的相互作用的方法，通过发现和鉴定新的病原菌因子和宿主因子，并研究病原菌蛋白和宿主蛋白相互作用网络，非编码RNA和蛋白相互作用，泛素系统中的关键分子及与其相互作用的蛋白分子在人类重要病原菌感染过程中的免疫调控作用及分子机制，重点发现和研究新的病原菌因子和宿主因子新的调控机制，确定侵入和存活缺陷突变株，高通量地分析菌体分泌蛋白在宿主细胞中的诱导表达。
附图说明
[0019]图1为本专利技术流程结构示意图。
具体实施方式
[0020]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0021]根据图1所示：
[0022]S1、挑选100个结核分枝杆菌H37Rv毒力相关蛋白构建诱饵载体，筛选和文献挖掘结核分枝杆菌H37Rv与宿主相互作用蛋白，确定3个与结核分枝杆菌H37Rv侵入和存活相关的已知的宿主细胞关键受体及关键信号转导分子，筛选出40个与结核分枝杆菌H37Rv侵入或存活相关的新的候选宿主细胞因子，建成含4000个突变株的结核分枝杆菌H37Rv的转座子文库，获得结核分枝杆菌H37Rv与宿主蛋白相互作用对；
[0023]S2、进一步利用已知关键受体或信号分子基因敲除宿主感染模型来检测分析其感染结核分枝杆菌H37Rv后的存活，确定3个与结核分枝杆菌H37Rv 侵入和存活相关的已知的宿主细胞关键受体及关键信号转导分子对宿主感染发病的调控机制，筛选确定出5个与结核分枝杆菌H37Rv侵入或存活相关的新的候选宿主细胞因子，筛选确定与结核分枝杆菌H37Rv侵入或存活相关的结核分枝杆菌H37Rv的突变株，确定在宿主细胞中的高表达的菌体分泌蛋白；
[0024]S3、选择调控结核分枝杆菌H37Rv致病性的关键受体进一步以细胞转染模型，从第二轮RNA干扰选中选择3个，确定2个与结核分枝杆菌H37Rv致病性相关的关键受体，解析结核分枝杆菌H37Rv侵入和存活的免疫信号通路机制，确定3个新的巨噬细胞表面细胞受体或关键信号转导分子调控结核分枝杆菌H37Rv在侵入和胞内存活的作用机制，挑选3个可能在结核分枝杆菌 H37Rv侵入及胞内存活过程中发挥重要作用的相互作用蛋白进行表达并纯化，确定3个可能在结核分枝杆菌H37Rv侵入及胞内存活过程中发挥重要作用的相互作用蛋白的复合体的晶体结构和功能；
[0025]S4、挑选3个可能在结核分枝杆菌H37Rv侵入及胞内存活过程中发挥重要作用的相
互作用的蛋白，研究其对结核分枝杆菌H37Rv致病机制及信号通路调控机制，与宿主和结核分枝杆菌H37Rv中的相互作用蛋白形成的复合体的晶体结构和功能，挑选3个差异蛋白分子，进行RNA干扰CD4+T细胞来检测对T细胞的分化，确定3个结核分枝杆菌H37Rv相互作用蛋白对的调控结核分枝杆菌H37Rv致病机制及信号通路调控机制，确定3个关键蛋白分子对 CD4+T细胞功能的影响及调控结核分枝杆菌H37Rv侵入巨噬细胞及胞内存活的分子机制。
[0026]尽管已经示出和描述了本专利技术的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本专利技术的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本专利技术的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通量鉴定病原菌与宿主分子之间的相互作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、通过利用宿主细胞的模式识别受体和宿主免疫系统中的一些关键受体信号和传导分子等基因，敲除宿主信息分子分离出巨噬细胞；S2、挑选S1中获得的巨噬细胞感染病原菌，使用含有报告基因质粒的病原菌感染经过基因组RNA干扰转染的巨噬细胞，选择3
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6个巨噬细胞表面细胞受体，通过RNA干扰或基因敲除后研究其病原菌在侵入和在细胞内存活的作用机制；S3、进一步利用基因敲除宿主信息分子获得感染模型，检测分析宿主感染病原菌后的存活、细胞因子和免疫细胞亚群数量的变化及功能；S4、将针对在宿主细胞内特异表达的靶蛋白的编码基因采用敲除、互补等遗传分析方法，构建相应的基因工程菌株，通过质粒转染表达在相关的细胞模型和动物模型中，进一步鉴定和确认靶蛋白与病原菌的胞内生存是否相关；S5、采用RNA干扰和抗体干扰等技术，阐明宿主细胞蛋白在病原菌感染中的应答及信号路调控机制，利用荧光标记、免疫组化以及细胞实时成像等技术，研究病原菌在细胞内所分泌蛋白的定向运输和分布定位。2.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋宁宁，李兆利，宋金妙，林红，王书贤，王慧，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：