一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法技术

本发明专利技术涉及药敏检测技术领域，特别涉及一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法。该方法包括：将血液阳性样本与表面活性剂溶液混合，离心后弃去上清；清洗后得到沉淀的菌体；配制菌悬液；将菌悬液加至药敏芯片靶板上，使药敏芯片靶板上每个点样位置上菌体的数量低于质谱检测阈值，然后进行孵育，孵育完成之后吸弃上部液体，对药敏芯片靶板上点样位置上的物质的进行质谱检测；根据质谱检测结果进行药敏结果判读，确定敏感、中介、耐药信息。本发明专利技术可对经过预处理的临床报阳血瓶直接进行药敏试验，无需再次转接纯化等操作，与现有方法相比，不仅可以节约时间，同时操作相对简单快速，无需很高的动手能力，对人员的专业程度要求较低。低。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法


[0001]本专利技术涉及药敏检测
，特别涉及一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法。

技术介绍

[0002]近年来菌血症或真菌血症的发病率持续增加，在各种感染中居首位，且死亡率高(20％
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50％)，危害严重，有文献报道，血流感染病原菌鉴定报告时间每延迟1h，患者存活率降低7.6％。临床医师做到对血流感染快速诊断和及时用药是提高存活率的关键因素。血培养是诊断血流感染的主要手段。血培养是采集患者血液标本并接种到培养瓶中，经过24h
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5d的培养进行增菌，用以发现、识别引起菌血症或真菌血症的病原微生物，该方法是诊断菌血症和真菌血症的主要方法。血培养结果对感染性疾病的诊断、治疗和预后都有极为重要的临床意义。
[0003]目前血培养阳性标本检测的主要步骤是先用一次性无菌注射器抽取培养液至血平板、巧克力平板进行转接培养，同时进行革兰染色镜检，根据染色反应及菌株形态特征，将染色结果作危急值报告；转接培养好的平板挑取菌落做革兰染色，根据染色结果选择鉴定步骤及药敏试验，出鉴定及药敏结果后对临床发最终报告。按照常规步骤，获取血培养阳性标本鉴定结果最快需要18
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48h，获得药敏结果最快需要20
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48h。
[0004]目前常用的微生物检测方法为形态学特征、生理生化反应、血清学反应和测序，形态学和生化是目前临床上最常用的方法，形态学法是根据微生物在固/液体培养基上的生长状态及染色反应、显微镜下观察结果来初步进行物种鉴定，该方法成本较低、检测速度相对较快，但对操作者的专业要求较高，且大部分微生物形态无明显种特异性，很容易出现误判，鉴定种类有限。生理生化反应法流程比较繁琐，需要先判断是革兰氏阳性菌还是阴性菌，然后再根据形态、酶反应、显色等不同方法，将具体微生物种类鉴定出来。血清学反应是利用已知菌种的抗血清，观察与待鉴定菌是否发生特异性的血清学反应来鉴定其种类，该技术检测速度较快，但该方法只是其他鉴定方法的一个补充手段，且操作繁琐，对操作人员要求较高，且血清检测需要购买专用的试剂盒，成本较高，技术受限程度较大，而能通过血清学检测的临床菌种一般只有大概确定菌种名称之后才能进行血清学检验，常见的有沙门氏菌、志贺菌等，适用的菌种较少。测序技术是从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，不依赖菌种本身特点，对所有菌种均可使用，鉴定准确率高，是目前微生物鉴定技术的金标准。但由于测序技术检测成本高，耗时长，现阶段难以在临床大规模推广，临床仍以传统微生物检测方法(形态/生化)为主。随着感染微生物的复杂程度不同，传统微生物检测时间长到几天，短到几小时都有可能，且能鉴定出来的种类有限，准确度一般。相比传统方法而言，MALDI
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TOF MS质谱仪具有鉴定速度快、准确和低成本等绝对优势，已经成为临床微生物检验领域最富有生命力的新技术之一。
[0005]目前国内外学者也有尝试将质谱技术应用于临床样本的直接检测，并取得了显著的进展，针对不同标本各专家有不一样的前处理技术，离心、过滤、表面活性剂等，且通过质
谱对临床样本进行直接检测这一技术正逐步获得临床和微生物实验室的认可，这大大缩短了临床报告的时间。
[0006]但是，在医学领域不仅需要快速鉴定，还需要检测出对常用抗生素的耐药性。由于近年来抗生素的滥用，导致耐药菌的大量增加，临床在不知道其耐药性的情况下将无法有效控制并治疗疾病，因此，不仅有必要对血液或其他体液感染性微生物进行快速鉴定，还有必要快速确定其对不同抗生素的耐药性，这对临床的抗感染治疗具有非常重要的意义。
[0007]常规药敏检测的方法较多，主要有纸片扩散法、微量肉汤稀释法(金标准)、E
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test法和全自动药敏仪法。(1)纸片扩散法，是将配制好的菌悬液均匀涂布在MH琼脂培养基上，室温干燥后，将含药纸片紧贴于培养基表面，孵育16
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24h，根据测量的抑菌圈直径，然后按照CLSI标准判读，报告敏感(S)、中介(I)和耐药(R)；(2)微量肉汤稀释法，是一定浓度的抗菌药物与待测菌的培养液进行一系列的双倍稀释，恒温培养16
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24h后，通过观察培养液中细菌生长现象来判断药物对待测菌的最低抑制浓度，及MIC值；(3)E
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test法，是将配制好的菌悬液均匀涂布在MH琼脂培养基上，室温干燥后，将含药纸片紧贴于培养基表面，孵育16
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24h，通过观察MH琼脂培养基上的细菌生长现象直接测定药物对待测菌的MIC值；(4)全自动微生物药敏检测系统，是一套微生物药敏检测的智能系统，其原理是微量肉汤稀释法，操作相对简单，只需配制一定麦氏单位的菌悬液，插到药敏卡上上机自动检测，10
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24h左右查看耐药结果及MIC值。
[0008]前三种方法是CLSI上推荐的方法，其中微量肉汤稀释法被视为金标准，但其操作步骤比较繁琐，且耗时长达16
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24小时，很难满足临床危重病人的检测需求。纸片扩散法对药敏纸片的质量、MH琼脂培养基上菌液的涂布、抑菌圈的测量等手工操作要求较高，因对人员依赖较大，导致检测结果准确性不好，且鉴定耗时长达16
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24小时，很难满足临床危重病人的检测需求。全自动微生物药敏检测系统操作简便，上手较快，但其对药敏板卡的依赖性较大，目前市面上采用的药敏板卡种类比较单一，药物浓度梯度范围较窄，临床上根据需求可能还需要加测，也不利于耐药性的长期监测，耗时也较长，这些方法均不能及时的给患者做一个全面的药敏检测。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本专利技术提供了一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法。该方法操作简单，可大大缩短了血液感染性微生物的鉴定和药敏检测时间。
[0010]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0011]本专利技术提供了一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法，包括以下步骤：
[0012]菌体富集：将血液阳性样本与表面活性剂溶液混合，离心后弃去上清；所得沉淀与清洗液混合并离心，弃去上清，得到沉淀的菌体；
[0013]药敏检测：配制菌悬液；将菌悬液加至药敏芯片靶板上，使药敏芯片靶板上每个点样位置上菌体的数量低于质谱检测阈值，然后进行孵育，孵育完成之后吸弃上部液体，对药敏芯片靶板上点样位置上的物质的进行质谱检测；根据质谱检测结果进行药敏结果判读，药敏芯片靶板上质谱检测出微生物的位置认为有微生物生长，而无法检测出微生物的点认为微生物生长被抑制，依据该信息得到MIC值，再依据CLSI、专家共识、EUCAST指南确定敏感、中介、耐药信息。
[0014]作为优选，药敏芯片靶板包括阳性药敏芯片靶板和阴性药敏芯片靶板，阳性药敏芯片靶板上包被有阳性菌适用的抗生素药物，阴性药敏芯片靶板上包被有阴性菌适用的抗生素药物；
[0015]药敏检测步骤之前还包括血液革兰氏染色步骤，根据革兰氏染色步骤确定菌为阳性菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法，其特征在于，包括以下步骤：菌体富集：将血液阳性样本与表面活性剂溶液混合，离心后弃去上清；所得沉淀与清洗液混合并离心，弃去上清，得到沉淀的菌体；药敏检测：配制菌悬液；将菌悬液加至药敏芯片靶板上，使药敏芯片靶板上每个点样位置上菌体的数量低于质谱检测阈值，然后进行孵育，孵育完成之后吸弃上部液体，对药敏芯片靶板上点样位置上的物质的进行质谱检测；根据质谱检测结果进行药敏结果判读，药敏芯片靶板上质谱检测出微生物的位置认为有微生物生长，而无法检测出微生物的点认为微生物生长被抑制，依据该信息得到MIC值，再依据CLSI、专家共识、EUCAST指南确定敏感、中介、耐药信息。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药敏芯片靶板包括阳性药敏芯片靶板和阴性药敏芯片靶板，所述阳性药敏芯片靶板上包被有阳性菌适用的抗生素药物，所述阴性药敏芯片靶板上包被有阴性菌适用的抗生素药物；所述药敏检测步骤之前还包括血液革兰氏染色步骤，根据所述革兰氏染色步骤确定菌为阳性菌或阴性菌；所述药敏检测步骤包括：根据菌种不同选用不同的药敏芯片靶板：当菌为阳性菌时，选择阳性菌药敏芯片靶板进行药敏检测；当菌为阴性菌时，选择阴性菌药敏芯片靶板进行药敏检测。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述阳性药敏芯片靶板包括96孔平面靶板和包被在平面靶板上的抗生素，在96孔平面靶板上的96个孔位内分别添加的抗生素和主要浓度为：孔位1
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4：阿米卡星(AN)：4，16，32，64孔位5
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9：庆大霉素(GM)：1，2，4，8，16孔位10
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16：左氧氟沙星(LEV)：0.125，0.25，0.5，1，2，4，8孔位17
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19：氨曲南(ATM)：4，8，16孔位20
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25：亚胺培南(IPM)：0.5，1，2，4，8，16孔位26
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31：美罗培南(MEM)：0.25，0.5，1，2，4，8孔位32
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37：替加环素(TGC)：0.5，1，2，4，8，16孔位38
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41：头孢呋辛(CXM)：1，4，8，16孔位42
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47：头孢他啶(CAZ)：1，2，4，8，16，32孔位48
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54：头孢曲松(CRO)：1，2，4，8，16，32，64孔位55
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60：头孢吡肟(FEP)：1，2，4，8，16，32，孔位61
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64：头孢西丁(FOX)：8，16，32，64孔位65
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69：多粘菌素B(PB)：0.5，1，2，4，8孔位70
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73：米诺环素(MI)：2，4，8，16孔位74
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76：氨苄西林/舒巴坦(SAM)：8/4，16/8，32/16孔位77
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81：复方新诺明(SXT)：1/19，2/38，4/76，8/152，16/304孔位82
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85：头孢他啶/阿维巴坦(CZA)：0.5/4，8/4，16/4，32/4孔位86
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91：哌拉西林/他唑巴坦(TZP)：4/4，8/4，16/4，32/4，64/4，128/4
孔95：阴性对照孔96：阳性对照。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述阴性药敏芯片靶板包括96孔平面靶板和包被在平面靶板上的抗生素，在96孔平面靶板上的96个孔位内分别添加的抗生素和主要浓度为：孔位1
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【专利技术属性】
技术研发人员：曹洁茹，蔡克亚，赵高岭，刘美丽，李越峰，封松利，蔡艳婷，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：