腐霉利、克百威和多菌灵三联免疫层析检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供一种腐霉利、克百威和多菌灵三联免疫层析检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒包括样品提取净化管、带反应孔的反应基板和腐霉利、克百威和多菌灵三联免疫层析检测试纸条。本发明专利技术提供的三合一胶体金免疫层析检测试剂盒，可以实现现场、多通量、快速准确地对蔬菜中残留的腐霉利、克百威和多菌灵进行同时提取、净化和检测，大幅简化前处理流程，提高检测效率，为食品安全生产、基层监管、食品稽查、大型活动保障等提供有力技术支撑。型活动保障等提供有力技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
腐霉利、克百威和多菌灵三联免疫层析检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及农药残留检测
，具体地说，涉及一种腐霉利、克百威和多菌灵三联免疫层析检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]腐霉利(Procymidone)，化学名称N
‑
(3，5
‑
二氯苯基)
‑
1，2
‑
二甲基环丙烷
‑
1，2
‑
二甲酰基亚胺，是一种低毒性杀菌剂，可抑制菌体内甘油三酯的合成。克百威(Carbofuran)，化学名称2，3
‑
二氢
‑
2，2
‑
二甲基
‑7‑
苯并呋喃基甲氨基甲酸酯，是一种氨基甲酸酯类杀虫剂和杀线虫剂。多菌灵(Carbendazin)，化学名称2
‑
(甲氧基氨基甲酰)苯并咪唑，是一种高效低毒杀菌剂，可用于防治多种植物病害。腐霉利、克百威和多菌灵是植物栽培过程中常用的农药。目前蔬菜中腐霉利、克百威、多菌灵农药残留的检出率高，不合格率也高，且现有检测方法相对繁琐。
[0003]根据国家标准，腐霉利的检测方法是气相色谱
‑
质谱联用法，克百威的检测方法是液相色谱
‑
柱后衍生法，多菌灵现行有效的检测方法是液相色谱
‑
串联质谱法。上述方法虽然稳定性好、准确率高、重复性强，但是需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员以及复杂的前处理过程，对环境不友好、无法满足及时检出、现场办公、现场执法的要求。并且前处理方法和使用的仪器设备均有不同，因此对几种农残同时检测的目标，更是难以实现。
[0004]在快检方法中，应用较多的有表面增强拉曼光谱法、免疫层析试纸快速检测法。但是很多检测对象没有拉曼信号，而免疫层析试纸检测对象单一，且不同检测对象的前处理方法也不尽相同，不利于几种农残的同时检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种腐霉利、克百威和多菌灵三联免疫层析检测试剂盒及检测方法。
[0006]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种腐霉利、克百威和多菌灵三联免疫层析检测试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，所述硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫的方向上依次设有三条检测线和一条质控线，三条检测线分别包被有腐霉利半抗原
‑
载体蛋白偶联物、克百威半抗原
‑
载体蛋白偶联物和多菌灵半抗原
‑
载体蛋白偶联物，所述质控线包被有羊抗鼠多克隆抗体。
[0007]所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次以2
‑
3mm的间距交互层叠黏贴在底板上。
[0008]检测线上包被的腐霉利半抗原
‑
载体蛋白偶联物的浓度为0.10
‑
0.20mg/mL，优选0.15mg/mL。
[0009]检测线上包被的克百威半抗原
‑
载体蛋白偶联物的浓度为0.25
‑
0.8mg/mL，优选0.6mg/mL。
[0010]检测线上包被的多菌灵半抗原
‑
载体蛋白偶联物的浓度为0.25
‑
0.6mg/mL，优选
0.5mg/mL。
[0011]质控线上包被的羊抗鼠多克隆抗体的浓度为0.25mg/mL。
[0012]腐霉利半抗原、克百威半抗原、多菌灵半抗原的结构分别如式1)～式3)所示：
[0013]式1)腐霉利半抗原
[0014]式2)克百威半抗原
[0015]式3)多菌灵半抗原
[0016]优选地，载体蛋白为牛血清蛋白。
[0017]硝酸纤维素膜上的各检测线之间，以及靠近吸水垫端的检测线与质控线之间的距离均为4
‑
5mm，优选4.3mm。在本专利技术中，如果相邻的两条检测线距离太近，显色会有干扰；如果距离太远，则层析时间过长，且需要更多的检测液。
[0018]所述试纸条的宽度为3
‑
5mm，优选3.8mm。试纸条过窄不利于结果的判断，过宽则需要更多的抗原、抗体与检测液，不利于节约成本。
[0019]所述样品垫的材质可以是硝酸纤维素膜。底板的材质可以是PVC。
[0020]图1为本专利技术免疫层析检测试纸条的结构示意图。
[0021]第二方面，本专利技术提供腐霉利、克百威和多菌灵三联免疫层析检测试剂盒，包括样品提取净化管(含样品提取净化液)、带反应孔的反应基板和所述三联免疫层析检测试纸条。样品提取净化管、反应基板、免疫层析检测试纸条密封后装入试剂盒中，4℃保存。
[0022]所述样品提取净化管的制备方法包括：将200mg PSA(N
‑
丙基乙二胺固相吸附剂)、200mg C
18
(十八烷基键合硅胶)和30mg GCB(石墨化碳黑)置于5mL离心管中，再加入2mL 0.05mol/L pH7.4的PBS混匀，即为装有样品提取净化液的样品提取净化管。
[0023]所述反应孔包被有胶体金标记的腐霉利抗体、胶体金标记的克百威抗体和胶体金标记的多菌灵抗体。反应孔的底面积为0.32cm2，容积为365μL，亦可直接使用96孔板作为反应孔，以便大批量的制备试剂盒。
[0024]所述反应孔的制备方法包括：将胶体金标记的腐霉利抗体溶液2μL、胶体金标记的克百威抗体溶液3μL和胶体金标记的多菌灵抗体溶液2μL加入反应孔中，用冻干保护液稀释至60μL，进行真空冷冻干燥。
[0025]优选地，所述冻干保护液为：2％BSA、5％海藻糖、1％PEG 20000、0.5％吐温20和0.03％ProClin 300，以水配制。
[0026]优选地，胶体金标记的腐霉利抗体溶液的制备方法包括：取1mL胶体金溶液，加入
0.2mol/L K2CO3溶液5
‑
10μL(优选7μL)，混合均匀后，加入腐霉利抗体6μg，混合均匀，25℃静置10min；然后加入10％BSA封闭液(质量百分数)50μL，混合均匀，25℃静置15min；然后4℃，11000rpm离心15min，弃上清，加入200μL复溶液，即得。
[0027]优选地，胶体金标记的克百威抗体溶液的制备方法包括：取1mL胶体金溶液，加入0.2mol/L K2CO3溶液6
‑
12μL(优选7μL)，混合均匀后，加入克百威抗体5μg，混合均匀，25℃静置10min；然后加入10％BSA封闭液(质量百分数)50μL，混合均匀，25℃静置15min；然后4℃，11000rpm离心15min，弃上清，加入200μL复溶液，即得。
[0028]优选地，胶体金标记的多菌灵抗体溶液的制备方法包括：取1mL胶体金溶液于反应孔，加入0.2mol/L K2CO3溶液3
‑
7μL(优选4μL)，混合均匀后，加入多菌灵抗体6μg，混合均匀，25℃静置10m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.腐霉利、克百威和多菌灵三联免疫层析检测试纸条，其特征在于，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，所述硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫的方向上依次设有三条检测线和一条质控线，三条检测线分别包被有腐霉利半抗原
‑
载体蛋白偶联物、克百威半抗原
‑
载体蛋白偶联物和多菌灵半抗原
‑
载体蛋白偶联物，所述质控线包被有羊抗鼠多克隆抗体；所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次以2
‑
3mm的间距交互层叠黏贴在底板上。2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，检测线上包被的腐霉利半抗原
‑
载体蛋白偶联物的浓度为0.10
‑
0.20mg/mL，优选0.15mg/mL；检测线上包被的克百威半抗原
‑
载体蛋白偶联物的浓度为0.25
‑
0.8mg/mL，优选0.6mg/mL；检测线上包被的多菌灵半抗原
‑
载体蛋白偶联物的浓度为0.25
‑
0.6mg/mL，优选0.5mg/mL；质控线上包被的羊抗鼠多克隆抗体的浓度为0.25mg/mL；腐霉利半抗原、克百威半抗原、多菌灵半抗原的结构分别如式1)～式3)所示：3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，硝酸纤维素膜上的各检测线之间，以及靠近吸水垫端的检测线与质控线之间的距离均为4
‑
5mm，优选4.3mm；所述试纸条的宽度为3
‑
5mm，优选3.8mm。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫的材质为硝酸纤维素膜。5.腐霉利、克百威和多菌灵三联免疫层析检测试剂盒，其特征在于，包括样品提取净化管、带反应孔的反应基板和权利要求1
‑
4任一项所述的试纸条。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述样品提取净化管的制备方法包括：将200mg PSA、200mg C
18
和30mg GCB置于5mL离心管中，再加入2mL 0.05mol/L pH7.4的PBS混匀，即为装有样品提取净化液的样品提取净化管。7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述反应孔包被有胶体金标记的腐霉利抗体、胶体金标记的克百威抗体和胶体金标记的多菌灵抗体；
所述反应孔的制备方法包括：将胶体金标记的腐霉利抗体溶液2μL、胶体金标记的克百威抗体溶液3μL和胶体金标记的多菌灵抗体溶液2μL加入反应孔中，用冻干保护液稀释至60μL，进行真空冷冻干燥；其中，胶体金溶液的制备方法为：先将2g氯金酸粉末溶于1...

【专利技术属性】
技术研发人员：周陶鸿，冀威昊，彭青枝，曹玉，范志勇，张莉，
申请(专利权)人：湖北省食品质量安全监督检验研究院，
类型：发明
国别省市：