基于生物芯片的小分子多联检试剂盒及其制备方法、检测方法技术

本发明专利技术公开了基于生物芯片的小分子多联检试剂盒及其制备方法、检测方法。所述试剂盒中包含纳米金颗粒标记抗体、多联检芯片板和检测缓冲液；所述纳米金颗粒标记抗体包含被纳米金颗粒标记的氟苯尼考抗体和恩诺沙星抗体；所述多联检芯片板的若干个检测孔中同时包被有氟苯尼考抗原和恩诺沙星抗原；所述检测缓冲液由10～40mM磷酸缓冲液、0.05～0.5wt％的表面活性剂S17组成。本发明专利技术通过检测缓冲液及其与检测体系中的其他试剂的配合优化，可以利用一种检测缓冲液即能够同时检测氟苯尼考和恩诺沙星小分子，省时省力。省时省力。省时省力。

【技术实现步骤摘要】
基于生物芯片的小分子多联检试剂盒及其制备方法、检测方法


[0001]本专利技术属于传感和免疫分析
，特别涉及基于Nano SPR生物芯片的小分子多联检试剂盒及其制备方法、检测方法。

技术介绍

[0002]等离子体纳米孔阵列(NanoSPR)，由于其具有独特的三维结构，不同于平面模型的SPR效应，也不同于金属纳米颗粒的LSPR效应，可以同时支持SPR与LSPR两种模式。纳米孔阵列生物传感器的等离子共振效应可以直接入射到纳米孔金属结构，表面光场立即激发，因此不需要复杂的光路和大型光学仪器的支持。NanoSPR纳米孔阵列生物传感器保留了传统SPR传感器的实时、无需标记、无背景干扰、高分辨率等诸多优点。NanoSPR传感器也保留了LSPR传感器在性能改造上的优势，通过对纳米孔阵列的孔径、深度、形状、周期以及表面金属的类型、厚度等参数的调节，选择出可以捕捉到存在LSPR最强信号的高品质芯片，无需大型光谱仪也可以得到更强的信号。
[0003]基于上述优点，NanoSPR生物传感器的检测能力能够满足生物分子传感检测的实际需求，广泛应用于生物医药检测、药物分析、食品安全、环境检测和细胞生物学等领域。抗生素是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，抗生素被广泛应用，可能会造成抗生素在动物源性食品中的残留，抗生素有多种分类，例如，磺胺类、氟喹诺酮、β
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内酰胺类抗生素、头孢氨苄、林可霉素、替米考星
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泰乐菌素、地塞米松、氯霉素、四环素、庆大霉素、氟苯尼考、红霉素、链霉素、苯甲酸、新霉素、金霉素、土霉素、沙星类、孔雀石绿或结晶紫。毒素是由各种生物(动物、植物、微生物)产生的有毒物质，指生物来源并不可自复制的有毒化学物质，例如，黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮。
[0004]氟苯尼考(Florfenicol)属于氯霉素类广谱抗菌药，主要用于治疗鱼、猪、牛及家禽的细菌性感染病的防治，具有抗菌广谱、吸收好，体内分布广、安全高效等特点。氟苯尼考在安全性和有效性方面比氯霉素和甲砜霉素有明显的优势，已在养殖业中大规模使用。恩诺沙星(enrofloxaicn)是近年来迅速发展起来的一类动物专用的广谱抗生素。在化学结构上，本类药物属于吡酮酸衍生物，抑制细菌DNA螺旋酶，抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透能力强，抗菌作用是磺胺类的近千倍，可广泛用于动物细菌性疾病和支原体感染方面的防治。然而，随着畜禽养殖业的发展，氟苯尼考、恩诺沙星的滥用导致其在畜禽体内产生了巨大潜在危害，危害公众健康，我国发布的GB 31650
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2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中规定氟苯尼考、恩诺沙星在不同动物组织中的残留限量。
[0005]现有技术中，针对氟苯尼考或恩诺沙星的检测方法包括液质联用法、酶联免疫法、试纸条法等，但不同的小分子检测缓冲液可能不通用，因此检测不同的分子需要用不同的缓冲液稀释样本，分别进行检测，耗时耗力。因此，目前还没有基于Nano SPR生物芯片并且可以同时实现氟苯尼考和恩诺沙星多联检或其他抗生素小分子的多联检技术。

技术实现思路

[0006]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了基于生物芯片的小分子多联检试剂盒，所述试剂盒中仅含有一种检测缓冲液，即可同时用于稀释含有氟苯尼考和恩诺沙星的样本，用于多种抗生素小分子的同时检测，省时省力。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供上述基于生物芯片的小分子多联检试剂盒的制备方法。
[0008]本专利技术的另一目的在于提供利用上述基于生物芯片的小分子多联检试剂盒的检测方法。
[0009]上述专利技术目的通过以下技术方案予以实现。
[0010]基于生物芯片的小分子多联检试剂盒，所述试剂盒中包含纳米金颗粒标记抗体、多联检芯片板和检测缓冲液；
[0011]所述纳米金颗粒标记抗体包含被纳米金颗粒标记的氟苯尼考抗体和恩诺沙星抗体；所述多联检芯片板的若干个检测孔中同时包被有氟苯尼考抗原和恩诺沙星抗原；所述检测缓冲液由10～40mM磷酸缓冲液、0.05～0.5wt％的表面活性剂S17组成。
[0012]本专利技术的检测缓冲液仅由磷酸缓冲液和表面活性剂S17组成即可，无需再额外添加其他缓冲液(如tris溶液)或促反应试剂(如PEG2W、PEG6K、NaCl、EDTA、PVP等)。检测缓冲液体系简单且可用于稀释含不同抗原的样本，利于多种抗生素小分子的同时检测。
[0013]优选的，所述检测缓冲液由30mM磷酸缓冲液、0.05wt％的表面活性剂S17组成。
[0014]优选的，纳米金颗粒标记氟苯尼考抗体中氟苯尼考抗体：金颗粒的用量比为4μL：1.5mL，纳米金颗粒标记恩诺沙星抗体中恩诺沙星抗体：金颗粒的用量比为6μL：1.5mL。
[0015]优选的，所述试剂盒还包括所述纳米金颗粒标记抗体的复溶缓冲液，所述复溶缓冲液包括：25mM pH9.0 tris溶液、0.05wt％聚乙二醇20000、0.4wt％蔗糖、3wt％海藻糖、2wt％甘露醇。
[0016]优选的，所述多联检芯片板的其他检测孔中还包被有除氟苯尼考和恩诺沙星以外的其他小分子抗原，所述试剂盒中还含有与所述其他小分子抗原种类相对应的纳米金颗粒标记抗体。
[0017]本专利技术所述小分子多联检试剂盒是利用包括有不同抗原的芯片板(可由NanoSPR芯片与无底的96孔板制作而成)进行检测，待测样品中的小分子与芯片板表面相应的抗原竞争结合相应的纳米金颗粒标记抗体，当待测样品中没有小分子时，纳米金颗粒标记抗体与芯片板表面抗原反应产生较大的反应信号，当待测样品中有小分子时，纳米金颗粒标记抗体与待测样品的小分子结合，而不与芯片板表面抗原反应从而产生较小或没有反应信号。
[0018]所述其他小分子可包含小分子抗生素类、毒素类中的一种或多种；所述小分子抗生素类包括磺胺类、氟喹诺酮、β
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内酰胺类抗生素、头孢氨苄、林可霉素、替米考星
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泰乐菌素、地塞米松、氯霉素、四环素、庆大霉素、氟苯尼考、红霉素、链霉素、苯甲酸、新霉素、金霉素、土霉素、沙星类、孔雀石绿或结晶紫中的一种或多种；所述毒素类包含黄曲霉毒素M1、B1或玉米赤霉烯酮中的一种或多种。故本专利技术可实现8联检、16联检、192联检或更多联检。
[0019]优选的，所述检测缓冲液中磷酸缓冲液的pH为7.5。
[0020]本专利技术还提供所述的基于生物芯片的小分子多联检试剂盒的制备方法，包括：
[0021]多联检芯片板的制备：将NanoSPR芯片与无底微孔板组装，获得纳米等离子共振传感检测板；所述检测板的每个微孔依次用超纯水、无水乙醇进行清洗，氮气吹干；在若干个所述微孔中加入氟苯尼考抗原和恩诺沙星抗原，用微孔板封口膜封闭后于4℃过夜，即获得所述多联检芯片板；
[0022]纳米金颗粒标记抗体的制备：取两组相同体积的金颗粒溶液，向两组中分别加入tris溶液，分别混匀；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于生物芯片的小分子多联检试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含纳米金颗粒标记抗体、多联检芯片板和检测缓冲液；所述纳米金颗粒标记抗体包含被纳米金颗粒标记的氟苯尼考抗体和恩诺沙星抗体；所述多联检芯片板的若干个检测孔中同时包被有氟苯尼考抗原和恩诺沙星抗原；所述检测缓冲液由10～40mM磷酸缓冲液、0.05～0.5wt％的表面活性剂S17组成。2.根据权利要求1所述的基于生物芯片的小分子多联检试剂盒，其特征在于，所述检测缓冲液由30mM磷酸缓冲液、0.05wt％的表面活性剂S17组成。3.根据权利要求1所述的基于生物芯片的小分子多联检试剂盒，其特征在于，纳米金颗粒标记氟苯尼考抗体中氟苯尼考抗体：金颗粒的用量比为4μL：1.5mL，纳米金颗粒标记恩诺沙星抗体中恩诺沙星抗体：金颗粒的用量比为6μL：1.5mL。4.根据权利要求1所述的基于生物芯片的小分子多联检试剂盒，其特征在于，还包括所述纳米金颗粒标记抗体的复溶缓冲液，所述复溶缓冲液包括：25mM pH9.0 tris溶液、0.05wt％聚乙二醇20000、0.4wt％蔗糖、3wt％海藻糖、2wt％甘露醇。5.根据权利要求1所述的基于生物芯片的小分子多联检试剂盒，其特征在于，所述多联检芯片板的检测孔中还包被有其他小分子抗原，所述试剂盒中还含有与所述其他小分子抗原种类相对应的纳米金颗粒标记抗体。6.权利要求1～5任一项所述的基于生物芯片的小分子多联检试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：多联检芯片板的制备：将NanoSPR芯片与无底微孔板组装，获得纳米等离子共振传感检测板；所述检测板的每个检测孔依次用超纯水、无水乙醇进行清洗，氮气吹干；在若干个所述检测孔中加入氟苯尼考抗原和恩诺沙星抗原，用微孔板封口膜封闭后于4℃过夜，即获得所述多联检芯片板；纳米金颗粒标记抗体的制备：取两组相同体积的金颗粒溶液，向两组中分别加入tris溶液，分别混匀；再向第一组中加入氟苯尼考抗体，向第二组中加入恩诺沙星抗体，两组分别混匀，静置；两组再分别加入牛血清白蛋白混匀，静置，冷冻离心，去上清后取沉淀，即获得所述纳米金颗粒标记抗体；其中，第一组所述氟苯尼考抗体：金颗粒溶液的用量比为4μL：1.5mL，所述恩诺沙星抗体：金颗粒溶液的用量比为6μL：1.5mL。7.根据权利要求6所述的基于生物芯片的小分子多联检试剂盒的制备方法，其特征在于，所述金颗粒标记抗体的制备过程中，向第一组、第二组中加入的tris溶液分别是pH＝9.0的4μL、6μL的0.1M t...

【专利技术属性】
技术研发人员：周陶鸿，黄丽萍，彭青枝，樊洪利，冀威昊，周翰霖，龚蕾，曾少奇，刘钢，
申请(专利权)人：湖北省食品质量安全监督检验研究院，
类型：发明
国别省市：