一种基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法及检测试纸条技术方案

本发明专利技术涉及分子检测技术领域，尤其是一种基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法及检测试纸条，该方法通过在侧向层析试纸或附件上设置Cas蛋白和固定的标记探针，来实现侧向层析可视化检测，还可实现多指标联合检测。标记探针上含有相连的核酸探针和标记物，Cas蛋白上含可靶向待检测分子的引导序列，当检测样本中含有待检测分子，Cas蛋白被激活后切割标记探针中的核酸探针，从而使原本固定于侧向层析试纸或附件的标记物被释放。本发明专利技术将标记探针固定，被切割后标记物质才被释放并通过夹心法或捕获法试纸条进行检测，提高了检测的特异性，避免了现有技术中假阳性问题。避免了现有技术中假阳性问题。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法及检测试纸条


[0001]本专利技术涉及分子检测
，具体领域为一种基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法及检测试纸条。

技术介绍

[0002]CRISPR分子检测是2017年由博德研究所张锋团队首先开发出来的新型分子检测技术，主要原理是利用Cas蛋白接触并结合靶向片段后，本身的无差别反式切割功能被激活，会切割附近一切核酸序列的特点，通过检测探针序列被切割情况从而判断靶向片段是否存在的一种检测方法(Gootenberg,Jonathan,S,et al.Nucleic acid detection with CRISPR
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Cas13a/C2c2.[J].Science,2017.)。
[0003]2019年，张锋团队将CRISPR方法和侧向层析试纸结合起来推出了SHERLOCK技术(Kellner M J,Koob J G,Gootenberg J S,et al.SHERLOCK:nucleic acid detection with CRISPR nucleases[J].Nature Protocols,2019,14(10))。该方法在系统中引入了一段在两端分别标记生物素(Biotin)和荧光素(FAM)的探针序列。采用的侧向层析试纸条可以检测同时含有Biotin和FAM的序列：在近端的条带处包被有可结合Biotin的亲和素(SA)，在胶体金上标记有抗FAM抗体，另外远端还有一条条带，包被有可与抗FAM抗体结合的二抗。这是一种夹心法的试纸条，当样品中存在同时含有Biotin和FAM的序列时，会在近端的条带处形成SA
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Biotin
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探针
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FAM
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抗FAM抗体
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胶体金复合物，从而显色。
[0004]张锋团队将该夹心法试纸条用竞争法方式使用。样本为阴性时，CRISPR系统未激活，探针完整，同时标记有生物素(Biotin)和荧光素(FAM)的探针序列不会被切割，所以，胶体金全部被试纸条近端的SA条带处通过夹心法被完全捕获，不会到达试纸条远端的线。
[0005]当样本为阳性时，两端分别标记有生物素(Biotin)和荧光素(FAM)的探针序列被切断，近端条带处不能形成SA
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Biotin
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探针
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FAM
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抗FAM抗体
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胶体金复合物，胶体金越过近端条带到达远端条带显色，呈现为阳性结果。
[0006]在张锋团队开发的方法中，这种夹心法试纸条采用竞争法方式判读：当远端条带显色时候为阳性，远端条带不显色时候为阴性，这个远端条带是常规夹心法试纸条中的质控线。
[0007]2019年之后所有将CRISPR系统和试纸条结合的检测方法(比如STOPcovid、STOPcovid2、HOLMESv2)都采用同样的试纸条和判读方式。
[0008]在中国专利技术专利申请CN112708660A中，采用了将同样的探针固定到各种材质的微球载体上，在Cas蛋白反应的液相体系中加入微球，等反应结束之后分离微球，然后仍旧采用这种试纸条进行判读。
[0009]这种方式存在严重的弊端，夹心法试纸条很难保证所有胶体金都被近端条带捕获，这一点可以从常规夹心法试纸条强阳性时，仍然会有远端的质控线条带看出。从SHERLOCKv2、STOPcovid、STOPcovid2、HOLMESv2等技术的原始文献图片中也能看到，文献中显示阴性试纸条远端条带处都存在较弱显色。对此，本申请专利技术人团队也曾采用文献中同
一来源的试纸条尝试过，阴性时候远端条带确实存在，也就是，存在较弱的假阳性。更严重的，如果体系中未加入探针，则直接出现远端线，也就是出现强烈假阳。针对较弱假阳，本申请专利技术人团队设计的一个可行的改进方法是改变判读方式，即规定远端条带比近端条带显色弱为阴性，但这样会极大的降低体系灵敏度，而且比色法判读提高了对使用者的要求。
[0010]另外，现有的这种竞争法的方式，难以开发多指标联合检测。

技术实现思路

[0011]为了解决现有技术中的上述两种弊端，本专利技术的目的在于提供一种灵敏度高、无假阳性的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法及检测试纸条，并可以实现基于CRIPSR系统的多指标联合可视化检测。
[0012]为实现上述目的，本专利技术具体提供如下技术方案：
[0013]一种基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法，所述方法包括：
[0014]标记探针的切割，所述标记探针含有连接在一起的核酸探针和标记物，当所述核酸探针接触到激活后的Cas蛋白，则所述核酸探针被切割；
[0015]标记物的释放：所述标记探针固定设置于侧向层析试纸，当所述核酸探针被切割，所述标记物从固定处释放；
[0016]标记物的检测：所述侧向层析试纸采用夹心法或捕获法方式检测被释放的标记物，从而实现待检测分子的检测。
[0017]进一步的，所述核酸探针可被激活后的Cas蛋白或工程化的微小Cas蛋白切割。
[0018]进一步的，所述核酸探针为双链DNA序列、单链DNA序列、单链RNA序列和双链RNA序列中的任意一种或多种。
[0019]进一步的，所述标记探针固定设置于所述侧向层析试纸上；优选的，所述标记探针固定设置于固相载体上；更优选的，所述标记探针固定设置于磁微粒上。
[0020]进一步的，所述标记物包含有不少于两个抗原决定簇。
[0021]进一步的，所述Cas蛋白设置于所述侧向层析试纸上，所述侧向层析试纸设置有不少于两个，每个所述侧向层析试纸上的Cas蛋白包含有不同的引导序列。
[0022]当采用捕获法时，所述标记物为有色染料或有色微球标记的分子，该分子可被侧向层析试纸捕获。
[0023]一种基于CRISPR系统的分子侧向层析检测试纸条，包括侧向层析试纸，所述侧向层析试纸设置有Cas蛋白，所述Cas蛋白设置有可靶向待检测分子的引导序列，所述试纸条还包括固定的标记探针，所述标记探针包含相连的核酸探针和标记物。
[0024]进一步的，所述标记物由有色或无色微球或胶体金组成，所述微球上包含不少于一个抗原决定簇。
[0025]进一步的，所述微球上包含抗体或抗原，可通过捕获法进行检测。
[0026]进一步的，所述侧向层析试纸依次设置有样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫；
[0027]所述Cas蛋白设置于所述样品垫上；
[0028]所述标记探针固定设置于所述样品垫上；
[0029]所述结合垫上设置有第一抗标记物抗体
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标记载体复合物；
[0030]所述NC膜上设置有检测线，所述检测线包被有标记物捕获物。
[0031]进一步的，所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴于所述背板上。
[0032]进一步的，所述结合垫、NC膜本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法，包括标记探针的切割、标记物的释放、侧向层析试纸检测过程，其特征在于，所述方法包括：标记探针的切割：所述标记探针包含相连的核酸探针和标记物，当所述核酸探针接触到被待检测分子激活后的所述Cas蛋白，所述核酸探针被切割；标记物的释放：所述标记探针固定设置，所述标记物包含有不少于两个抗原决定簇，当所述核酸探针被切割，所述标记物从固定处释放；标记物的检测：所述侧向层析试纸采用夹心法或捕获法检测被释放的标记物，从而实现待检测分子的检测。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法，其特征在于，所述核酸探针可被激活后的Cas蛋白或工程化的微小Cas蛋白切割。3.根据权利要求1所述的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法，其特征在于，所述核酸探针为双链DNA序列、单链DNA序列、单链RNA序列和双链RNA序列中的任意一种或多种的组合。4.根据权利要求1所述的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法，其特征在于，所述标记探针固定设置于所述侧向层析试纸上。5.根据权利要求1所述的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法，其特征在于，所述标记探针固定设置于固相载体上。6.根据权利要求5所述的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法，其特征在于，所述标记探针固定设置于磁微粒上。7.一种基于CRISPR系统的分子侧向层析检测试纸条，包括侧向层析试纸和Cas蛋白，其特征在于，所述试纸条还包括固定的标记探针，所述标记探针包含相连的核酸探针和标记物，所述标记物包含有不少于两个抗原决定簇。8.根据权利要求7所述的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测试纸条，其特征在于，所述标记物由有色或无色微球或胶体金组成，所述微球上包含不少于一个抗原决定簇。9.根据权利要求8所述的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测试纸条，其特征在于，所述微球上包含抗体或抗原，可通过捕获法进行检测。10.根据权利要求7所述的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测试纸条，其特征在于，所述侧向层析试纸设置有背板、样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫；所述Cas蛋白设置于所述样品垫上；所述标记探针固定设置于所述样品垫上；所述结合垫上设置有第一抗标记物抗体
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标记载体复合物；所述NC膜上设置有检测线，所述检测线包被有第二抗标记物抗体。11.根据权利要求10所述的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测试纸条，其特征在于，所述NC膜上设置有检测线，所述检测线包被有标记物捕获物。12.根据权利要求10所述的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测试纸条，其特征在于，所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴于所述背板上。13.根据权利要求10所述的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测试纸条，其特征在于，所述结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴于所述背板上，所述样品垫单独设置。14.根据权利要求10所述的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测试纸条，其特征在于，
所述核酸探针的一端与所述样品垫固定结合，所述核酸探针的另一端偶联所述标记物。15.根据权利要求10所述的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测试纸条，其特征在于，所述核酸探针设置有亲和素标记，所述样品垫化学偶联有链霉亲和素，所述标记探针通过生物素
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亲和素系统固定于所述样品垫上。16.根据权利要求10所述的基于CRISPR系统的分子侧向层析检测试纸条，其特征在于，所述标记探针一端有生物素标记，含有一段可被Cas蛋白切割的区域，另一端含有另一个小分子标记，并被该小分子的抗体结合，该小分子的抗体含有两种或以上不同的小分子标记；所述样品垫上化学偶联有链霉亲和素，所述标记探...

【专利技术属性】
技术研发人员：李诗焱，
申请(专利权)人：固安北吉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：