基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸及制备方法技术

本发明专利技术设计一种基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸及制备方法，该试纸包括支撑底板，在支撑底板上按顺序依次固定有样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜和吸水垫；其中金标蛋白垫由玻璃纤维棉包被，固定有胶体金标记的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白；层析检测膜为硝酸纤维素膜，其上设置有检测线和质控线，其中检测线上固定有葡萄球菌蛋白A，质控线上固定有抗非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。该试纸特异、敏感、快捷、简便，可用于ASFV血清学诊断和流行病学调查，易于在生产实践中推广应用。易于在生产实践中推广应用。易于在生产实践中推广应用。

【技术实现步骤摘要】
基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸及制备方法


[0001]本专利技术涉及一种基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸及制备方法，属于免疫检测


技术介绍

[0002]病原的抗体检测是评价动物是否感染某种病原的主要手段。病毒侵入机体后，体内会产生相应的特异性抗体，通过检测血液样本中的特异性抗体的存在及含量，可间接判断病毒感染情况。和直接检测病原方法比，抗体检测的血液标本更易获取且标本质量有保证，检测灵敏度高，在疫病检测和监测方面不易漏检。目前用于抗体检测的方法主要是酶联免疫吸附试验(ELISA)，但ELISA检测方法不仅需要专门仪器，且操作繁琐，时间长。胶体金免疫层析技术作为一种新型免疫层析技术，具有操作简单、10min左右出结果方便快捷、准确、判断直观等优点，广泛应用于医学检测和临床诊断，已成为目前快速检测的主要方向，具有广阔的应用前景。
[0003]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASF virus，ASFV)引起的一种猪的急性、高致死性传染病。我国2018年8月首次报告疫情来，该病严重威胁我国生猪养殖及相关产业。由于养殖地区环境污染、传染源与污染源尚未彻底消除，非洲猪瘟病毒污染环节和传播环节多样化，同时面临着非洲猪瘟病毒基因缺失毒株这一新的传染源，非洲猪瘟疫情形势十分严峻。根除非洲猪瘟是我国生猪产业生存和发展的必由之路，建立非洲猪瘟抗体快速检测技术对于检测、监测疫情，最终实现净化具有重要意义。
[0004]ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，为大型双链DNA病毒，主要在巨噬细胞胞质中复制，其基因组约170
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193kb，含有150
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167个开放阅读框，编码150
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200种蛋白质。目前已知功能的病毒编码蛋白约有50个，大部分为病毒的结构蛋白，其中由ASFV ORF B646L基因编码的p72是ASFV的重要抗原蛋白，是病毒二十面体的主要成分，约占蛋白总量的三分之一，对于病毒衣壳的形成至关重要。对受感染存活猪的血清中抗体分析发现病毒衣壳蛋白p72是免疫系统所识别的病毒主要抗原之一，可诱导机体产生特异性的体液免疫应答，且蛋白序列高度保守。有关研究表明，在不同地区由ASFV毒株诱导的p72抗体的相应抗原表位均相当保守，在血清学检测中，正确折叠的三聚体蛋白p72抗原是最具免疫原性的ASFV蛋白之一，是理想的检测靶标。
[0005]目前ASF防控中无疫苗和治疗性药物，因此对感染动物的早期检测对于控制该病的暴发及传播极其重要。为了满足非洲猪瘟病毒抗体的实时精准检测需求，我们建立了一种ASFV抗体检测胶体金免疫层析试纸条，能够用于检测可疑猪血清中的病毒抗体，适合现场ASFV血清学诊断、流行病学调查。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪
瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸及制备方法，该试纸特异、敏感、快捷、简便，可用于ASFV血清学诊断和流行病学调查，易于在生产实践中推广应用。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0008]一种基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸，包括支撑底板，在支撑底板上按顺序依次固定有样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜和吸水垫；其中金标蛋白垫由玻璃纤维棉包被，固定有胶体金标记的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白；层析检测膜为硝酸纤维素膜，其上设置有检测线和质控线，其中检测线上固定有葡萄球菌蛋白A，质控线上固定有抗非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。
[0009]所述胶体金标记的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的制备方法为：取1mL胶体金溶液，加入2μL 0.2mol/L K2CO3及120μL的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，室温反应5
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10min后，加入3％酪蛋白溶液100μL，室温封闭10min，以12 000r/min的速度离心25min，弃上清，加入100μL的含1.2wt％BSA、0.05wt％叠氮钠的PBS缓冲液重悬，即得。
[0010]所述胶体金溶液的制备方法为：取100mL超纯水，加入1mL 10g/L的氯金酸煮沸；在加热搅拌状态下迅速加入新鲜配制的1.6mL 10g/L的柠檬酸三钠溶液，观察颜色由无色
→
蓝色
→
深红色
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亮红色，直至颜色不再发生变化，待溶液冷却至室温，用超纯水定容至100mL，4℃避光保存。
[0011]所述非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的制备方法为：
[0012]根据GenBank:MK333180.1获取编码p72蛋白的基因序列B646L和其伴侣蛋白基因序列B602L，分别在蛋白N段添加His和Flag标签，构建pCMV载体，进行密码子优化，交由上海生工生物工程有限公司合成，得到两个质粒，分别命名为pCMV
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B646L和pCMV
‑
B602L；
[0013]将两个质粒共转染到HEK293F细胞，HEK293F细胞的密度为2.0
×
106cells/mL，培养72h后以100g/min的转速离心10min收取细胞；弃去培养液后，加入400mM NaCl和20mM HEPES Buffer重悬细胞沉淀，进行超声破碎，超声3s间隔4s，共超声20min；然后以12000rpm/min的转速离心15min；
[0014]收集离心后的上清，经0.45um滤膜过滤后，使用Ni
‑
NAT亲和层析柱，经100mM的咪唑洗去杂质，300mM的咪唑洗脱纯化后，再经超滤浓缩及凝胶过滤层析纯化处理后，分离得到非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，分装后于
‑
80℃保存备用。
[0015]所述抗非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的多克隆抗体制备方法为：
[0016]以权利要求4制备的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白为免疫原免疫健康新西兰兔，首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，以200μg/只的剂量皮下多点注射；每次加强免疫间隔3周，以弗氏不完全佐剂乳化抗原进行注射；最后一次加强免疫2周后，将非洲猪瘟病毒p72重组蛋白以1.6μg/mL的浓度，每孔50μL的用量包被酶联免疫吸附板，用ELISA方法测定免疫血清抗体效价；当效价达到1:6.4
×
104时，采集高免兔全血，37℃放置2h后，于4℃分离血清，以3000rpm/min的速度离心10min，收取上清；
[0017]取1mL上清，将上清逐滴加入10mL含18％(wt)的无水硫酸钠溶液中，于37℃温箱静置2h，以10000r/min的速度离心20min，弃上清；取沉淀用1mL的超纯水重悬，用生理盐水进行透析，换液3
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4次，即得，分装后冻存，备用。
[0018]所述的胶体金免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸，其特征在于，包括支撑底板，在支撑底板上按顺序依次固定有样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜和吸水垫；其中金标蛋白垫由玻璃纤维棉包被，固定有胶体金标记的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白；层析检测膜为硝酸纤维素膜，其上设置有检测线和质控线，其中检测线上固定有葡萄球菌蛋白A，质控线上固定有抗非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。2.如权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述胶体金标记的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的制备方法为：取1mL胶体金溶液，加入2μL 0.2mol/L K2CO3及120μL的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，室温反应5
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10min后，加入3％酪蛋白溶液100μL，室温封闭10min，以12 000r/min的速度离心25min，弃上清，加入100μL的含1.2wt％BSA、0.05wt％叠氮钠的PBS缓冲液重悬，即得。3.如权利要求2所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述胶体金溶液的制备方法为：取100mL超纯水，加入1mL 10g/L的氯金酸煮沸；在加热搅拌状态下迅速加入新鲜配制的1.6mL 10g/L的柠檬酸三钠溶液，观察颜色由无色
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蓝色
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深红色
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亮红色，直至颜色不再发生变化，待溶液冷却至室温，用超纯水定容至100mL，4℃避光保存。4.如权利要求2所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的制备方法为：根据GenBank:MK333180.1获取编码p72蛋白的基因序列B646L和其伴侣蛋白基因序列B602L，分别在蛋白N段添加His和Flag标签，构建pCMV载体，进行密码子优化，交由上海生工生物工程有限公司合成，得到两个质粒，分别命名为pCMV
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B646L和pCMV
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B602L；将两个质粒共转染到HEK293F细胞，HEK293F细胞的密度为2.0
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106cells/mL，培养72h后以100g/min的转速离心10min收取细胞；弃去培养液后，加入400mM NaCl和20mM HEPES Buffer重悬细胞沉淀，进行超声破碎，超声3s间隔4s，共超声20min；然后以12000rpm/min的转速离心15min；收集离心后的上清，经0.45um滤膜过滤后，使用Ni
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NAT亲和层析柱，经100mM的咪唑洗去杂质，300mM的咪唑洗脱纯化后，再经超滤浓缩及凝胶过滤层析纯化处理后，分离得到非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，分装后于
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80℃保存备用。5.如权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述抗非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的多克隆抗体制备方法为：以权利要求4制备的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白为免疫原免疫健康新西兰兔，首次...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔松林，耿瑞，杨继飞，马红芳，李睿，孙彦刚，王磊，孙亚宁，张改平，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：