噬菌斑的培养和观察方法技术

本发明专利技术为一种噬菌斑的培养和观察方法，以大肠杆菌为宿主，分离噬菌体，培养噬菌斑，包括水样的预检、制备菌悬液、水样处理与噬菌体增殖、噬菌体增殖液的稀释、噬菌体

【技术实现步骤摘要】
噬菌斑的培养和观察方法


[0001]本专利技术属于微生物
，涉及一种噬菌斑的培养和观察方法。

技术介绍

[0002]噬菌体(phage)是感染细菌、放线菌及蓝细菌等原核生物的病毒，是遗传学、分子生物学和基因工程的常见实验材料，广泛存在于自然界的各个生境中。根据其侵染宿主后是否裂解宿主，可分为烈性噬菌体和温和噬菌体。烈性噬菌体会侵染宿主在菌苔上形成一个个具有一定形状、大小、边缘和透明度的噬菌斑。因每种噬菌体的噬菌斑有一定的形态，故可用作噬菌体的鉴定指标，也可用于纯种分离和计数。
[0003]噬菌体的分离纯化是普通微生物学实验、病原微生物学实验和环境工程微生物学实验等课程的必做项目之一。噬菌斑的培养和观察，是本实验项目的核心技术。目前，国内外教材多沿用Adams1959年专利技术的双层平板法，其主要步骤为:预先分别配制含2％和0.7％琼脂的底层培养基和上层培养基。先用底层培养基在培养皿上浇一层平板,待凝固。再把预先融化并冷却到45℃的上层培养基混合较浓的敏感宿主和一定体积的噬菌体待检液，混匀后铺平在已凝固的底层平板上，如存在能裂解宿主菌的噬菌体，则培养一段时间后，出现肉眼可见的噬菌斑。该方法存在几个显著的缺点：
[0004](1)使用预先融化的上层培养基混合宿主和噬菌体，温度很难把握。低于45℃，上层琼脂在混合过程中即凝固，高于60℃，则噬菌体有灭活的风险，所以初学者往往手忙脚乱，且上层琼脂很容易因凝固而出现琼脂块。
[0005](2)肉眼观察难度大。虽然用底层培养基补平，避免了玻璃培养皿底部凹凸不平，但由于大肠杆菌菌落无色半透明，琼脂虽透明亦呈现淡黄色，仅凭肉眼观察，初学者很难辨识噬菌斑。
[0006](3)培养基营养丰富，对实验环境和操作技术要求较高，很容易被环境中的其它微生物污染，干扰实验结果。
[0007](4)观察时间苛刻。尽管多数教程规定培养后18
‑
24h观察。但实际上噬菌斑的最佳观察时间在培养的4
‑
20h之间，超过20h往往会出现斑块界限模糊，可能是因为上层培养基很软，方便宿主或污染的其它杂菌在琼脂表面运动。
[0008]此外，在噬菌斑培养前期的噬菌体增殖环节，教材多选用大容量污水(200ml)直接增殖噬菌体。该步骤有两个缺陷，一是实验材料体积较大，操作不便；二是污水中同时包含多种微生物，这些微生物均可在营养丰富的牛肉膏蛋白胨液体培养基中增殖，因此，本步骤并没有选择性的增殖大肠杆菌噬菌体。
[0009]为了增加噬菌斑和背景的对比度，研究人员在上层琼脂中添加红四氮唑等染料，但染料对大肠杆菌的生长存在一定的抑制。或在培养后用2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，染色后倾去染料，染料被菌苔中的活细胞还原，从而使噬菌斑和菌苔呈现鲜明对比。然而上层琼脂软(0.7％)，硬度低，且大肠杆菌菌落与培养基结合不紧密，染色过程中很容易将菌苔冲起或将上层培养基破坏，进而也无法观察和计数噬菌斑。

技术实现思路

[0010]本专利技术为一种改良的噬菌斑培养和观察方法，在双层平板法的基础上，将底层琼脂改成无营养物的水琼脂，同时将双层平板改成三层，即两层水琼脂中间夹一层半固体琼脂，将宿主菌和噬菌体局限在中间层，这样既降低了环境中微生物在平板上定殖的风险，也使形成的噬菌斑都接近于同一平面上，避免了噬菌斑的上下重叠。培养完毕，洗去表层水琼脂上污染的其它杂菌，用低浓度亚甲基蓝染色后可清晰的观察到噬菌斑，噬菌斑的大小接近、边缘清晰，无上下噬菌斑的重叠现象。专利技术包括以下步骤：
[0011]步骤1：水样预检，选择总大肠菌群阳性的环境水样为噬菌体分离培养材料。
[0012]步骤2：制备菌悬液，无菌操作从伊红美兰培养基上挑取选择一个深紫红色、有金属光泽的菌落的单菌落，接种5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃，150rpm培养1～3hour。
[0013]步骤3：水样处理与增殖噬菌体，取污水2ml，4℃，10000rpm离心1min，收集上清，上清中加0.2ml氯仿涡旋1min，静置，收集上层液体1ml添加于5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，同时添加0.2ml大肠杆菌的菌悬液，37℃，150rpm过夜培养以增殖噬菌体。
[0014]步骤4：噬菌体增殖液的稀释，取2ml噬菌体增殖液4℃，10000rpm离心1min收集上清液，上清加0.2ml氯仿涡旋震荡1min，静置，上层液体为富集的噬菌体样品。用1％蛋白胨水将富集的噬菌体样品10倍倍比稀释到10
‑3～10
‑7。
[0015]步骤5：噬菌体、宿主混合液的制备，在制备好的噬菌体梯度稀释液中添加大肠杆菌悬液，添加比例为每1ml稀释液添加50μl菌悬液，颠倒混匀。
[0016]步骤6：夹层平板法培养噬菌斑，在无菌平皿中加入约5ml水琼脂，冷却待凝固。再在将混匀的宿主
‑
噬菌体混合液倾倒在已经凝固的底层平板上，随即倾入一层保温的半固体培养基，混匀，每皿约10ml，静置待凝。最后，再倒入一层保温的水琼脂，每皿约10ml，凝固后倒置37℃培养过夜。
[0017]步骤7：染色观察噬菌斑，缓缓用流水清洗夹层平板表面，去除表面污染的杂菌和灰尘，吸干残水后用0.05％亚甲基兰水溶液染色2min，倾去染液，观察，背景为蓝色，大肠杆菌菌苔呈现不透明云雾状，噬菌斑为深蓝色圆形空斑。
[0018]本专利技术亦可用于其它噬菌体形成噬菌斑的培养与观察，但相关步骤需要做适当调整。
[0019]本专利技术的有益效果为：
[0020](1)增加了水样预检环节。由于噬菌体通常和其宿主共存在于特定生境中，而大肠杆菌是总大肠菌群的重要组成，如水样总大肠菌群检测阳性，则说明水体中存在大肠杆菌，水体也存在大肠杆菌的噬菌体。此外如实验室无适合的大肠杆菌菌株，可利用本步骤同时分离环境大肠杆菌菌株，针对水体中大肠杆菌分离特定的噬菌体。但如采用大肠杆菌的工程菌，如DH5α、BL21和JM109等，则不一定能保证实验成功。
[0021](2)宿主菌始终保持在伊红美兰培养基上传代。由于伊红美兰培养基为一种鉴别培养基，大肠杆菌在上面呈现独特的菌落特征，即深紫红色、有金属光泽、表面比较湿润的光滑菌落，至少保证了宿主的菌落纯，避免制备的菌悬液含有其它杂菌。
[0022](3)选择性增殖水体中的噬菌体。传统方法使用大剂量(200ml)污水直接增殖噬菌体，消耗试剂多，操作强度大。此外，由于牛肉膏蛋白胨液体培养基营养丰富，污水中的许多微生物都能在其中生长，因此选择性不强。本方法使用小剂量(2ml)污水，同时通过高速离
心和氯仿处理去除污水中的细胞，仅使用污水中的非细胞成分增殖噬菌体，增强了实验的选择性。
[0023](4)避免了操作过程中半固体培养基的凝固。传统方法中噬菌体梯度稀释液制备后，要在半固体培养基中混合宿主菌和噬菌体稀释液，操作时要求准确迅速，否则上层琼脂很容易出现琼脂块，干扰后期观察。本专利技术采用浇注平板法，首先在1％蛋白胨水中混合宿主菌和噬菌体稀释液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.本发明为一种噬菌斑的培养和观察方法，是一种可应用于高校教学或相关技术人员培训的实验方法。其原理为：噬菌体在自然界分布很广，有其宿主存在的地方都可以发现噬菌体。烈性噬菌体在固体平板上侵染并裂解敏感宿主形成噬菌斑。培养并观察噬菌斑可使学生掌握分离纯化噬菌体的基本原理和方法，了解噬菌体的特性，具体包括以下步骤：步骤1：水样预检，其特征是选择总大肠菌群阳性的环境水样为噬菌体分离培养材料。步骤2：制备菌悬液，其特征是无菌操作从伊红美兰培养基上挑取一个深紫红色、有金属光泽的单菌落，接种5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃，150rpm培养1～3hour。步骤3：水样处理与增殖噬菌体，其特征是取污水2ml，4℃，10000rpm离心1min，收集上清，上清中加0.2ml氯仿涡旋振荡1min，静置，收集上层液体1ml添加于5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，同时添加0.2ml大肠杆菌的菌悬液，37℃，150rpm过夜培养以增殖噬菌体。步骤4：噬菌体增殖液的稀释，其特征是取2ml噬菌体增殖液4℃，10000rpm离心1min收集上清液，上清加0.2ml氯仿涡旋震荡1min，静置，上层液体为富集的噬菌体样品。用1％的蛋白胨水将富集的噬菌体样品10倍倍比稀释到10
‑3～10
‑7。步骤5：噬菌体
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宿主混合液的制备，其特征是在制...

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊会，
申请(专利权)人：保定学院，
类型：发明
国别省市：