使用泊洛沙胺的病毒传导制造技术

本发明专利技术提供一种组合物，包括或由下述物质组成：(a)泊洛沙胺；(b)(i)逆转录病毒载体；和(ii)脊椎动物细胞。(ii)脊椎动物细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用泊洛沙胺的病毒传导


[0001]本专利技术涉及一种组合物，含有或由(a)泊洛沙胺；和(b)(i)逆转录病毒载体和或(ii)脊椎动物细胞组成。
[0002]本文中引用了大量文件，包括专利申请及制造商手册。这些文件的披露虽然不被认为与本专利技术的可专利性有关，但在此以整体引用的方式纳入本专利技术中。更具体的，所有引用的文件都通过相同程度的引用来纳入，就像每个单独的文件都明确地、单独地指明是通过引用来纳入的一样。

技术介绍

[0003]对于大部分细胞，特别是原代细胞的遗传修饰，优选的方法是通过病毒载体的介导转导。尤其是，使用逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。具有水泡性口炎病毒(VSV
‑
G)的糖蛋白的假型慢病毒(LV)载体稳定地整合到增殖和非增殖细胞的染色体中(布克林斯基(Bukrinsky)等，1993；伯恩斯(Burns)等，1993；芬克(Funke)等，2008)。LV的安全特性得到了改进，如第三代分裂基因组慢病毒的包装设计和转移载体3'长末端重复序列(LTR)的缺失等，使LV成为许多研究者青睐的系统(杜尔(Dull)等，1998)。经转导的慢病毒细胞几乎不显示应激信号通路的激活或任何其他表型改变，因此有望在基因治疗和免疫治疗中得到广泛应用(格鲁伯(Gruber)等，2000；鲁阿斯(Rouas)，2002)。
[0004]目前而言，在研究及临床实验中，涉及将LV基因有效传递到靶细胞的转导条件存在很大差异(米林顿(Millington)等，2009)。众所周知，正常的淋巴细胞和原发性肿瘤，以及淋巴系的细胞系难以有效转导(阿纳斯塔索夫(Anastasov)等，2009)(阿纳斯塔索夫(Anastasov)等，2010)。为了大规模转导病人细胞，向原代细胞的高基因转移率和能够产生高滴度病毒颗粒的能力是临床试验的先决条件。由于大规模生产这些病毒是十分复杂和昂贵的(乌姆(Wurm)等，2010)，对慢病毒转导率的每一项改进都将导致对病毒产量需求的减少，并将进一步有助于降低临床试验的成本。
[0005]可以通过各种不同的策略实现更高的基因转移效率：通过超速离心法(伯恩斯(Burns)等，1993)或超滤法(阿纳斯塔索夫(Anastasov)等，2009)浓缩病毒上清液也是一种可能提高基因转移效率的方法。其他被频繁使用的、用于提高基因转移率的方法为添加不同的试剂，例如聚阳离子或阳离子脂质体。但是，大部分这些辅助疗法对于细胞而言是有毒的，限制了其用于原发灶的敏感的靶细胞(乌姆(Wurm)等，2010)。在其他选项中，凝聚胺(一种线性聚阳离子聚合物)在大范围的靶细胞中提高了基因转导率，成为了本领域中一种主流的转导辅助试剂(卡斯特罗(Castro)等，1988；海塞(Hesse)，埃贝桑(Ebbesen)和克里斯滕森(Kristensen)，1978)。可惜，凝聚胺仅可作用于很短的应用时间，以及低于10ug/ml的浓度(取决于靶细胞的类型)，可用于避免细胞毒副作用和/或跨膜电位的显著调节(奥宾，尔德和帕特森(Aubin,Weinfeld,and Paterson)，1988)，这限制了其在敏感细胞，例如造血细胞中的使用。
[0006]另一种提高病毒转导效率的常规方法为使用纤维连接蛋白，能够促进慢病毒和靶
细胞共定位的重组人纤维连接蛋白片段(李(Lee)等，2009)。
[0007]Vectofusin
‑
1是一种相对较新的病毒转导增强子。它源于LHA4肽族，是一种富含组氨酸的阳离子两亲性肽(弗纳德(Fenard)等，2013)。它的作用是促进病毒和细胞膜之间的贴壁和融合，并被证明可以改善人类造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的转导(弗纳德(Fenard)等，2013；因戈劳(Ingrao)等，2014)。
[0008]进一步的，将病毒添加到细胞后，直接离心接种(通常称为“旋转接种(spinoculation)”)被转导的细胞也可以加强转导(郭(Guo)等，2011)。研究表明，离心诱发动态肌动蛋白和丝切蛋白的活性，导致HIV
‑
1受体和CD4和CXCR4共同受体的上调(郭(Guo)等，2011)。旋转接种也可以与转导增强子共同使用以进一步增强转导效率。
[0009]然而，另一种将治疗相关的物质传递到细胞的方法是将其包装成生物大分子或聚合物。对于如细胞外因子的蛋白质，已被证明将其包装成脂质体或磷脂和胆固醇可以增强稳定性和活性，从而提高在靶细胞上的生物活性(莫雷尔(Morrell)等，2008；蒂伊叙兹(T
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ys
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z)等，2017)。核酸也可以通过直线的(卡巴诺夫
·
朱和阿拉霍夫(Kabanov,Zhu,and Alakhov)2005；勒米厄和盖琳(Lemieux and Guerin)2000；马哈詹(Mahajan)等，2017；宋(Song)等，2014)和支链的两亲性共聚物实现非病毒式转移至细胞。进一步的，多种共聚物已经被证明有助于溶解疏水性药物胶束，以将其传递至靶细胞(阿卡霍夫(Alakhov)等，1999；阿尔瓦雷斯
·
洛伦佐(Alvarez
‑
Lorenzo)等，2010；基亚佩塔和索斯尼克(Chiappetta and Sosnik)，2007；埃鲁科娃(Erukova)等，2000)。这些聚合的物质除其他外，包括聚乙二醇(PEG)、聚环氧丙烷(PPO)、聚乳酸(PDLLA)、泊洛沙姆和泊洛沙胺。将药物封装在胶束的疏水内芯内可显著增加药物的溶解性、稳定性和被靶细胞吸收的能力。
[0010]Cas9蛋白质sgRNA核糖核蛋白(RNP)的复合物已经被证明对有效的基因修饰，同时将潜在的脱靶效应降至最低有价值(冈迪(Gundry)等，2016)。非病毒聚合物传递系统(如泊洛沙胺和其他聚合物)可作为有价值的工具，将RNP传递到靶细胞中，以纠正体外和体内遗传缺陷(可汗(Khan)等，2016)。
[0011]近期，已经进一步开发出了的非逆转录病毒载体，并被用于基于包膜疱疹病毒的基因转导载体，这样的包膜疱疹病毒包括HSV
‑
1、恒河巨细胞病毒(RhCMV)和MCMV，其神经基因转导能力和作为疫苗载体的良好特性而受到高度关注(汉森(Hansen)等，2011年；马可尼(Marconi)、曼塞维吉(Manservigi)和爱泼斯坦(Epstein)，2010年；莫尔(Mohr)等，2010年)。近期，源自属于沙粒病毒科的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(LCM)病毒的病毒载体在同源和异源疫苗接种方案中诱发了有效的免疫应答(温格苏(Wingerath)等，2017年)。

技术实现思路

[0012]本专利技术所要解决的技术问题为提供一种用于病毒载体转导细胞的改进手段和方法。
[0013]通过提供权利要求书中所描述的实施例实现上述技术问题的解决方案。
[0014]相应地，本专利技术的第一方面，涉及一种组合物，包括或由下述组分组成：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，其特征在于，包括或由下述物质组成：(a)泊洛沙胺；(b)(i)逆转录病毒载体；和(ii)脊椎动物细胞。2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，(a)所述泊洛沙胺为序贯泊洛沙胺；和/或(b)具有式(1)的结构R1R2N
‑
(CH2)2‑
NR3R4ꢀꢀꢀꢀ
(I)或者式(II):R1R2R5N
+
‑
(CH2)2‑
N
+
R3R4R6ꢀꢀꢀꢀ
(II)C
‑
l其中，在任一公式中，R1为H
‑
(O(CH2)2)
a
‑
(OCH(CH3)CH2)
b
‑
；R2为H
‑
(O(CH2)2)
c
‑
(OCH(CH3)CH2)
d
‑
；R3为
‑
(CH2CH(CH3)O)
e
‑
((CH2)2O)
f
‑
H；R4为
‑
(CH2CH(CH3)O)
g
‑
((CH2)2O)
h
‑
H；R5和R6各自为不存在或选自H、C
l
到C6烷基、C2到C6烯基和C2到C6炔基；其中，如果R5或R6不存在，则连接R5或R6的N不携带正电荷；C
‑
l代表一个或多个反离子，所述反离子使式(II)的结构呈电中性；a、c、f和h各自为从约25到约200、优选从约50到约120的整数；并且b、d、e和g各自为从约5到约50、优选从约10到约25的整数。3.如权利要求2(b)所述的组合物，其特征在于，a＝c；f＝h；b＝d；和/或e＝g；以及，优选地，a＝c＝f＝h；和/或b＝d＝e＝g。4.如权利要求2(b)或3所述的组合物，其特征在于，所述环氧丙烷
‑
环氧乙烷比率(#PO/#EO)定义为(b+d+e+g)/(a+c+f+h)，所述比率的范围为从约0.05到约1.5，优选从约0.1到约1.0，更优选从约0.15到约0.67，最优选从约0.18到约0.35。5.如权利要求1至4任一所述的组合物，其特征在于，进一步包括或由下述物质组成：(a)选自多阳离子聚合物或多阳离子肽的组中的一种或多种多阳离子物质；(b)前列腺素；(c)糖蛋白；(d)泊洛沙姆；和/或(e)环孢霉素；和/或(f)星状孢菌素。6.一种药物组合物，其包含或由权利要求1至5中任一所述的组合物构成，其特征在于，权利要求1至5中任一所述的组合物包含所述的病毒载体。7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，
所述逆转录病毒载体携带对患有疾病或有患上所述疾病的风险的个体有益的基因。8.泊洛沙胺在使用逆转录病毒载体转导脊椎动物细胞中的用途，其特征在于，所述用途中可选地还使用：(a)选自多阳离子聚合物或多阳离子肽的组中的一种或多种多阳离子物质；(b)前...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯蒂安，
申请(专利权)人：西瑞恩生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：