巴氏杆菌噬菌体培养基及培养方法技术

本发明专利技术涉及噬菌体培养技术领域，尤其涉及巴氏杆菌噬菌体培养基及培养方法。本发明专利技术提供的培养基包括水和：胰蛋白胨，酵母浸粉，氯化钠，磷酸氢二钾，硫酸镁。该培养基能够实现对巴氏杆菌噬菌体的大规模、高密度培养。实验表明，相对于其他组分组成的培养基，本发明专利技术提供的培养基能够更有效的培养巴氏杆菌噬菌体，获得更高的放罐效价。高的放罐效价。

【技术实现步骤摘要】
巴氏杆菌噬菌体培养基及培养方法


[0001]本专利技术涉及噬菌体培养
，尤其涉及巴氏杆菌噬菌体培养基及培养方法。

技术介绍

[0002]巴氏杆菌病(pasteurellosis):由多杀性巴氏杆菌引起的以出血性败血症或传染性肺炎为主要症状的人或动物传染病；人巴氏杆菌病通常呈现皮肤和软组织感染，引起人的急性或慢性呼吸道疾病。动物巴氏杆菌病常以败血症和出血性炎症为主要特征，生猪养殖场巴氏杆菌常引起肺炎或萎缩性鼻炎，造成重大经济损失。
[0003]目前，巴氏杆菌感染的防治仍主要依赖于抗生素，例如头孢类、青霉素类抗生素，链霉素、四环素和磺胺类药物也有一定的疗效。但随着抗生素的大规模使用，巴氏杆菌对抗生素的耐药性越来越明显。在全球限抗、禁抗的大背景下，对巴氏杆菌感染引起疾病的防治，仍亟待研发新的方法。
[0004]近年来，研究表明巴氏杆菌噬菌体可以特异性裂解巴氏杆菌，从而起到消灭病原阻断巴氏杆菌相关疾病传播的作用。但若要将巴氏杆菌噬菌体应用于巴氏杆菌感染导致疾病的治疗中，则需要大量的巴氏杆菌噬菌体。而噬菌体属于病毒，其培养宿主为细菌，且不同噬菌体的生长特性差异较大，很难针对不同噬菌体采用同一方法进行高密度培养。
[0005]目前，对巴氏杆菌噬菌体，特别是多杀性巴氏杆菌噬菌体的培养技术仍存在缺陷，无法实现巴氏杆菌噬菌体的高密度培养。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供巴氏杆菌噬菌体培养基及巴氏杆菌噬菌体的高密度培养方法。
[0007]本专利技术提供的培养基包括水和：胰蛋白胨10～15g/L，酵母浸粉10～20g/L，氯化钠3～7g/L，磷酸氢二钾0.1～0.3g/L，硫酸镁0.01～0.1g/L。
[0008]一些具体实施例中，所述培养基包括水和：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉15g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾0.25g/L，硫酸镁0.05g/L。
[0009]一些实施例中，所述巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌。具体的，所述巴氏杆菌为为分离自猪的多杀性巴氏杆菌。
[0010]本专利技术所述的培养基在巴氏杆菌噬菌体和/或巴氏杆菌培养中的应用。
[0011]本专利技术中，所述巴氏杆菌噬菌体为分离自猪的多杀性巴氏杆菌噬菌体。
[0012]本专利技术提供了一种巴氏杆菌噬菌体的培养方法，其将巴氏杆菌和巴氏杆菌噬菌体接种于本专利技术所述的培养基，然后进行培养。
[0013]本专利技术提供的培养方法中，先接入巴氏杆菌，待培养至OD值为1.5～2.0接入巴氏杆菌噬菌体。所述巴氏杆菌的接种密度为4
×
10
10
cfu。
[0014]接入巴氏杆菌噬菌体时，所述巴氏杆菌和巴氏杆菌噬菌体的数量比为1:10000。
[0015]所述培养的条件包括：接入噬菌体后，静置30min，然后在37℃、pH7.2条件下培养7
～10h。
[0016]本专利技术中，所述巴氏杆菌为分离自猪的多杀性巴氏杆菌；
[0017]所述巴氏杆菌噬菌体为分离自猪的多杀性巴氏杆菌噬菌体。
[0018]本专利技术所述培养方法培养获得的巴氏杆菌噬菌体培养液。
[0019]本专利技术还提供了一种治疗巴氏杆菌病的药物，其由所述的巴氏杆菌噬菌体培养液制得。
[0020]所述治疗巴氏杆菌病的药物的制备方法包括：将培养获得的巴氏噬菌体菌液，经过0.45微米和0.22微米两级微滤得到高密度巴氏杆菌噬菌体制剂。
[0021]本专利技术还提供了一种治疗巴氏杆菌病的方法，其为给予本专利技术所述的药物。
[0022]本专利技术提供的培养基包括水和：胰蛋白胨，酵母浸粉，氯化钠，磷酸氢二钾，硫酸镁。该培养基能够实现对巴氏杆菌噬菌体的大规模、高密度培养。实验表明，相对于其他组分组成的培养基，本专利技术提供的培养基能够更有效的培养巴氏杆菌噬菌体，获得更高的放罐效价。
具体实施方式
[0023]本专利技术提供了巴氏杆菌噬菌体培养基及培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。
[0024]本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，巴氏杆菌噬菌体和巴氏杆菌皆来自牧原公司兽医部研发中心。所述酵母浸粉为安琪酵母浸粉。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：
[0025]实施例1
[0026]1、种子液制备：
[0027]巴氏杆菌种子液制备：将巴氏杆菌菌株划线接种于TSA(胰蛋白胨大豆琼脂)固体平板，37℃培养24h，然后挑单菌落转接入TSB(Tryptone Soya Broth)培养基摇瓶中于37℃、140rpm摇床振荡培养12h得到纯培养种子菌液。
[0028]巴氏杆菌噬菌体种子制备：将10微升巴氏杆菌噬菌体液体均匀涂布于TSA双层平板于37℃培养24h，待平板表面出现噬菌斑后将噬菌斑刮下，用无菌TSB洗下，采用0.22微米滤膜过滤除菌。
[0029]噬双层平板制备过程及噬菌体效价检测方法：
[0030]①
底层平板制备：在无菌操作台内，待TSA培养基冷却至40
‑
50℃左右，以不烫手为宜，将灭菌过的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的蜀牛瓶，左手旋出瓶盖。右手拿蜀牛瓶，使瓶口迅速通过火焰2
‑
3次；在酒精灯火焰旁，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将蜀牛瓶中的培养基(约15～20ml)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，正置放于无菌操作台内；手不经过培养皿上方将皿盖打开，等待平板冷却凝固(10
‑
15min)后，旋转平板，使皿盖在下，皿底在上，放于冰箱4℃保存。
[0031]②
上层平板制备：取一系列试管，分别添加8ml培养基(含有0.9％琼脂的TSB培养
基，温度在50℃左右为宜，禁止凝固)；各试管中500ul的菌液与马血清(温度把控40℃左右防止凝固，以不烫手为宜，忌温度过高影响血清效果、烫死细菌)摇匀试管内液体，均匀涂布于配置好的TSA平板培养基上(边倒入边摇动平板使其迅速铺展表面)；待平板晾干后，划分区域并标记。
[0032]③
编号：取制备好的双层平皿4套，用记号笔标明样品信息及做样日期，另取8支无菌1.5ml离心管排列于试管架上，加入0.9ml生理盐水并标明梯度
[0033]④
稀释：准备好标准样品及需要检测的样品(如果为未除菌的的则需要用0.22um针头滤器进行过滤)，将待测噬菌体样品及标准样品以10倍比例稀释8个梯度。取一系列1.5ml离心管(标注梯度)，分别加入0.9ml无菌生理盐水于离心管中，将待测样品放在振荡器上振荡1min，确保样品完全混匀，10
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.培养基，其包括水和：胰蛋白胨10～15g/L，酵母浸粉10～20g/L，氯化钠3～7g/L，磷酸氢二钾0.1～0.3g/L，硫酸镁0.01～0.1g/L。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，包括水和：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉15g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾0.25g/L，硫酸镁0.05g/L。3.权利要求1或2所述培养基在巴氏杆菌噬菌体和/或巴氏杆菌培养中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述巴氏杆菌噬菌体为分离自猪的多杀性巴氏杆菌噬菌体，巴氏杆菌为分离自猪的多杀性巴氏杆菌。5.一种巴氏杆菌噬菌体的培养方法，其特征在于，将巴氏杆菌和巴氏杆菌噬菌体接种于权利要求1或2所述的培养基，然后进行培养。6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李国强，李海超，刘美，张媛媛，孔德江，常世恺，刘荣飞，曹凯典，
申请(专利权)人：河南兴华生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：