一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用技术

本发明专利技术属于生物免疫技术领域，具体涉及一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用；通过在大肠杆菌中表达重组SARS

【技术实现步骤摘要】
一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用


[0001]本专利技术属于生物免疫
，具体涉及一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。SARS
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CoV
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2属于冠状病毒科β冠状病毒属，是一种有包裹的正链单链RNA病毒，直径约80
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120nm，病毒基因组含29844个碱基，编码的病毒结构蛋白主要有刺突(Spike，S)蛋白，膜(membrane,M)蛋白和核衣壳(Nucleocapsid, N)蛋白。新型冠状病毒感染引起的疾病称为2019冠状病毒病(COVID
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19)，感染的症状可从轻度或极小的呼吸症状到急性呼吸窘迫综合征(ARDS)甚至死亡，目前对于COVID
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19没有特异治疗方法。早期快速诊断是防治的关键，对控制院内感染，切断疾病传播等至关重要。
[0003]目前，RT
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PCR已成为诊断COVID
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19的金标准，但是研究表明此方法对操作人员和实验室条件有很高的要求，此外，无症状感染者出现，且部分患者在疾病发作后病毒载量较低，因此迫切需要一种基于COVID
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19的病毒抗体的免疫学检测方法作为补充。
[0004]现有申请号为CN202010564744.1的专利文件公开了一种可分泌新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体，其是将SARS
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CoV
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2的N蛋白用生理盐水稀释后与Quick Anti
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body
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Mouse 3W佐剂混合后注射免疫Balb/c小鼠，取血清检测血清效价，将脾脏细胞和骨髓瘤细胞进行融合后培养，经克隆、冻存、纯化、透析、筛选后获得杂交瘤细胞株。
[0005]申请号为CN202010986023.X的专利文件公开了一种用于检测SARS
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CoV
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2病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用，其虽然也是采用重组N蛋白通过动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞培养筛选得到杂交瘤细胞，但其采用的重组N蛋白是通过新冠病毒基因组序列中编码N蛋白的核苷酸序列合成完整的开放读码框区域，并克隆到质粒载体pUC57上，设计上游引物和下游引物，并引入EcoRI/XhoI双酶切位点，经细胞转染和培养，纯化后得到带有组氨酸标签的重组N蛋白。
[0006]单克隆抗体是由单个B淋巴细胞产生的针对单个抗原决定族的单一抗体，因来自于一个B淋巴细胞，具有高度特异性而得到广泛应用。多由具有产生抗体功能的B淋巴细胞与具有永生功能的骨髓瘤细胞融合而形成的杂交瘤细胞分泌产生。因此不同的杂交瘤细胞株因其B淋巴细胞来源不同，所分泌的单克隆抗体多只有单一的反应性，即只能用于一种检测方法，筛选出分泌具有多反应性单克隆抗体的杂交瘤细胞株是一项巨大挑战。同时杂交瘤细胞株在传代过程中以及冻存与复苏过程中，常常导致分泌单克隆抗体能力的下降甚至丢失，获得稳定分泌单克隆抗体的细胞株也是一项挑战。

技术实现思路

[0007]本专利技术为解决上述问题，提供了一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用。
[0008]具体是通过以下技术方案来实现的：
[0009]一、一种分泌抗新型冠状病毒SARS
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CoV
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2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤 细胞株，命名为nCoVN3G6，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址为： 中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月01日，保藏编号为CCTCCNO:C2020255。
[0010]二、所述分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株建立方法，包括以下步骤：
[0011]1、重组核蛋白
[0012]根据公布的SARS
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CoV
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2基因组序列，人工合成编码SARS
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CoV
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2核衣壳蛋白的适于在大肠杆菌中表达的基因序列，并克隆到表达载体pET28a上。以重组表达载体转化感受态大肠杆菌BL
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21，涂LB卡那霉素平板，37℃条件下静置培养过夜，次日分别挑取单菌落，接种于3ml LB培养液中，37℃条件下振荡培养 16h，提取质粒，进行基因测序。将测序正确的重组表达质粒转化BL
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21菌，接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中管中，37℃条件下振荡培养过夜，再按1％的接种量分别接种于含50μg/ml卡那霉素200mlLB培养基三角瓶中扩大培养，在37℃条件下振荡培养至菌液A600值约为0.6时，加入终浓度为0.5M 的IPTG，37℃条件下振荡培养诱导4h。收集菌体超声破碎后离心，取上清，用用Ni2+亲和层析柱进行纯化，纯化表达产物经12％SDS
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PAGE及Western blot 进行鉴定分析。
[0013]2、细胞融合
[0014]用纯化后的重组SARS
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COV
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2核蛋白免疫BALB/C小鼠，按每只每次小鼠100 微克的剂量免疫，首次免疫使用弗氏完全佐剂乳化，二次免疫和三次免疫使用不完全佐剂乳化，免疫间隔时间为两周，三次免疫7d后经小鼠尾部采血测血清抗体效价。融合前3d加强免疫一次，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0按照常规方法进行细胞融合，经HAT选择培养筛选杂交瘤细胞。
[0015]3、筛选
[0016]使用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，3次有限稀释法亚克隆后，获得1 株稳定分泌抗SARS
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COV
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N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为 nCoVN3G6。
[0017]4、杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体鉴定
[0018]将杂交瘤细胞株nCoVN3G6分泌的单克隆抗体分别与SARS
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COV
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2感染细胞、流感病毒感染细胞、EV71病毒感染细胞和柯萨基病毒感染细胞进行反应，利用间接免疫荧光法进行特异性鉴定。
[0019]将分泌抗SARS
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CoV
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2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔制备腹水，对腹水的ELISA及免疫荧光效价、单克隆抗体的特异性及所分泌单克隆抗体亚类鉴定。
[0020]5、杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体稳定性检测
[0021]将杂交瘤细胞株nCoVN3G6，在含10％胎牛血清的1640培养基中培养，根据细胞生长状况3
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4天后1:4加入新鲜培养基后传代培养，连续传代30代后，取培养细胞上清液，进行免疫荧光、ELISA及本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.稳定分泌抗新型冠状病毒SARS
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CoV
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2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为nCoVN3G6，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月01日，保藏编号为CCTCC NO:C2020255。2.如权利要求1所述的稳定分泌抗新型冠状病毒SARS
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CoV
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2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6，其特征在于，所述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体重链为IgG2a，轻链为κ链。3.如权利要求1或2所述的分泌抗新型冠状病毒SARS
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CoV
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2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6，其特征在于，所述杂交瘤细胞株是通过在大肠杆菌中表达重组SARS
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COV
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2病毒N蛋白、纯化、动物免疫、细胞融合、筛选、鉴定过程获得。4.一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)重组核蛋白：在大肠杆菌中表达重组SARS
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2病毒N蛋白，采用Ni2+亲和层析柱进行纯化；(2)细胞融合：将纯化的重组核蛋白对小鼠进行免疫，将免疫鼠脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，培养得到杂交瘤细胞；(3)筛选：采用间接ELISA和间接免疫荧光法检测杂交瘤细胞上清液，筛选出分泌抗SARS
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2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6；(4)鉴定：采用间接免疫荧光法特异性鉴定杂交瘤细胞株nCoVN3G6分泌的单克隆抗体与SARS
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COV
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2感染细胞、流感病毒感染细胞、EV71病毒感染细胞和柯萨基病毒感染细胞之间的反应。5.如权利要求4所述的杂交瘤细胞株nCoVN3G6的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)重组核蛋白：根据公布的SARS
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CoV
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2基因组序列，人工合成编码SARS
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CoV
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2核衣壳蛋白的适于在大肠杆菌中表达的基因序列，并克隆到表达载体pET28a上，以重组表达载体转化感受态大肠杆菌BL
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21进行培养，提取质粒进行基因测序，将测序正确的重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL...

【专利技术属性】
技术研发人员：余福勋，查艳，詹琳，刘琳，杨斌，杨丽，
申请(专利权)人：贵州省人民医院，
类型：发明
国别省市：