用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体、嵌合抗体和双夹心ELISA检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体、嵌合抗体和双夹心ELISA检测试剂盒，所述单链抗体的序列如SEQ ID No:1所示。所述嵌合抗体包括所述的单链抗体和鸭IgG恒定区Fc段基因。所述双夹心ELISA检测试剂盒包括包被有捕获抗体的酶标板、检测抗体和酶标抗体；其中，所述捕获抗体为如上所述的嵌合抗体；所述检测抗体为鼠抗番鸭呼肠孤病毒多克隆抗体；所述酶标抗体为HRP标记的羊抗鼠IgG。本发明专利技术通过提供一种特异性识别番鸭呼肠孤病毒的抗体，并在此基础上通过鸭IgG恒定区Fc段基因进行修饰，降低排斥作用，提高重组后的嵌合抗体对于抗原的针对性识别，提高对番鸭呼肠孤病毒识别的敏感性。毒识别的敏感性。毒识别的敏感性。

【技术实现步骤摘要】
用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体、嵌合抗体和双夹心ELISA检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及病毒的特异性检测领域，具体地，涉及用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体、嵌合抗体和双夹心ELISA检测试剂盒。

技术介绍

[0002]番鸭“白点病”，因病死鸭肝脏和脾脏出现突出表面的坏死点而得名，是危害养鸭业的主要疾病之一，其病原是番鸭呼肠孤病毒(MDRV)，一年四季可经饮水、胚蛋、肌肉、滴鼻和爪垫注射等途径感染番鸭、半番鸭和麻鸭，45日龄以内(主要为2周龄以内)最易感。雏鸭感染后，机体细胞免疫和体液免疫功能下降，引发免疫抑制，进而继发其他疾病，呈现高达85％的发病率和接近55％的死亡率，即使耐过也往往变成僵鸭，给养鸭业造成了重大经济损失。因此，如何控制MDRV感染是养鸭业亟待解决的问题。
[0003]进行快速有效的诊断与监测是控制本病的前提。目前报道的检测MDRV感染的方法有病毒分离法、血清学方法和分子生物学法，但还没有确实可行的商品化诊断试剂，临床诊断多以经验判断为主。因此，探索快速、敏感、特异、低廉、简便、适于大规模诊断并监测MDRV感染的新技术，对于系统掌握第一手MDRV流行病学数据显得尤为重要。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术，本专利技术的目的在于针对现有技术中MDRV的检测方法存在的弊端，从而提供一种能够特异性检测MDRV感染，敏感度高，且适合大规模商品化进行诊断的用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体、嵌合抗体和双夹心ELISA检测试剂盒。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体，所述单链抗体的序列如SEQ ID No:1所示。
[0006]优选地，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。
[0007]本专利技术还提供了一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的嵌合抗体，所述嵌合抗体包括如上述所述的单链抗体和鸭IgG恒定区Fc段基因。
[0008]优选地，所述鸭IgG恒定区Fc段基因采用序列如SEQ ID No:2和SEQ ID No:3的引物对提取获得。
[0009]本专利技术还提供了一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的双夹心ELISA检测试剂盒，所述双夹心ELISA检测试剂盒包括包被有捕获抗体的酶标板、检测抗体和酶标抗体；其中，
[0010]所述捕获抗体为如上述所述的嵌合抗体；
[0011]所述检测抗体为鼠抗番鸭呼肠孤病毒多克隆抗体；
[0012]所述酶标抗体为HRP标记的羊抗鼠IgG。
[0013]优选地，所述捕获抗体的包被浓度为3
‑
6μg/mL。
[0014]优选地，所述双夹心ELISA检测试剂盒还包括封闭剂和显色剂。
[0015]优选地，所述封闭剂选自浓度为1％的明胶，且封闭温度为37℃，封闭时间为3
‑
18h；
[0016]所述显色剂选自TMB显色液，显色时间为5
‑
25min。
[0017]优选地，所述鼠抗番鸭呼肠孤病毒多克隆抗体为采用番鸭呼肠孤病毒中的σC蛋白免疫小鼠产生的多克隆抗体。
[0018]通过上述技术方案，本专利技术通过提供一种特异性识别番鸭呼肠孤病毒的单链抗体，并在此基础上通过鸭IgG恒定区Fc段基因进行修饰，降低排斥作用，提高重组后的嵌合抗体对于抗原的针对性识别，提高对番鸭呼肠孤病毒识别的敏感性。
附图说明
[0019]附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0020]图1是实施例1中的pUC57
‑
ScFv采用BamHI/HindIII双酶切后的鉴定图；
[0021]图2是实施例2中的鸭IgG恒定区Fc段基因的扩增产物的糖凝胶电泳图；
[0022]图3是实施例3中的pGEMT
‑
ScFv
‑
Fc采用NcoI/SphI双酶切后的鉴定图；
[0023]图4是实施例3中的pFBD
‑
ScFv
‑
Fc采用NcoI/SphI双酶切后的鉴定图；
[0024]图5是实施例3中的重组Bacmid和未发生转座的DH10Bac中的杆粒的扩增产物的糖凝胶电泳图；
[0025]图6是实施例3中的经过培养后的未转染的Sf9细胞；
[0026]图7是实施例3中的经过培养后的转染Sf9细胞；
[0027]图8是实施例3中的P2代病毒的扩增产物的糖凝胶电泳图；
[0028]图9是实施例3中的P2代病毒按照3pfu/cell的剂量感染Sf9细胞后的重组病毒表达ScFv
‑
Fc的SDS
‑
PAGE分析图；
[0029]图10是实施例3中的P2代病毒按照3pfu/cell的剂量感染Sf9细胞后的重组病毒表达ScFv
‑
Fc的Western blot鉴定图；
[0030]图11是实施例3中的纯化后的嵌合抗体的SDS
‑
PAGE分析图；
[0031]图12是检测例5中的编号为1
‑
6的样品的扩增产物的糖凝胶电泳图；
[0032]图13是检测例5中的编号为7
‑
22的样品的扩增产物的糖凝胶电泳图；
[0033]图14是检测例5中的编号为23
‑
30的样品的扩增产物的糖凝胶电泳图。
具体实施方式
[0034]以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。
[0035]具体地，本专利技术提供了一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体，其序列如SEQ ID No:1所示。
[0036]实施例1、单链抗体的制备：
[0037]1、根据MDRVσC基因序列，分析筛选了5个免疫原性高的疏水性区域的氨基酸多肽(分别编号为Seq5
‑
1、Seq5
‑
2、Seq5
‑
3、Seq5
‑
4、Seq5
‑
5)，序列见表1。
[0038]表1
[0039]多肽编号AA位点AA序列
Seq5
‑
11～23MSGTPAPPGYSVPSCSPGSRGLTSeq5
‑
2194
‑
210LIDPTYDTALLTPSPAFSeq5
‑
3222～238DDASTKESFSLSTTGSFSeq5
‑
4246～256AWIPVAPETKNSeq5
‑
536～55PVSRSDVEDLSRRLSSLQSS
[0040]2、将上述五个氨基酸多肽分别与KLH(血蓝蛋白)偶联后免疫小鼠，经三次免疫后收集小鼠的血清，以对应的氨基酸多肽为包被原，HRP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的序列如SEQ ID No:1所示。2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。3.一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的嵌合抗体，其特征在于，所述嵌合抗体包括如权利要求1或2所述的单链抗体和鸭IgG恒定区Fc段基因。4.根据权利要求3所述的嵌合抗体，其特征在于，所述鸭IgG恒定区Fc段基因采用序列如SEQ ID No:2和SEQ ID No:3的引物对提取获得。5.一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的双夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述双夹心ELISA检测试剂盒包括包被有捕获抗体的酶标板、检测抗体和酶标抗体；其中，所述捕获抗体为如权利要求3或4所述的嵌合抗体；所述检测抗体为鼠抗番鸭呼肠孤病毒多克隆抗体；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永娟，朱善元，郭长明，吴植，洪伟鸣，
申请(专利权)人：江苏农牧科技职业学院，
类型：发明
国别省市：