一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用，属于医药技术领域。本发明专利技术以大肠杆菌表达的黄热病毒E蛋白作为抗原，通过流式分选，从一例康复期患者的PBMCs中筛选到可以特异结合黄热病毒E蛋白的记忆B细胞，然后对筛选的单一B细胞进行RT

【技术实现步骤摘要】
一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用
[0001]本申请是原申请号为CN201810302091.2，原申请日为2018年04月04日，专利技术名称为一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用的分案申请。


[0002]本专利技术涉及一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用，属于医药


技术介绍

[0003]黄热病毒(yellow fever virus，YFV)，单股正链RNA病毒，属于黄病毒科黄病毒属，是一种蚊媒传播的可引起人类致病的病原体，同一科病毒还包括寨卡病毒(zika virus，ZIKV)、登革病毒(dengue virus，DENV)、西尼罗病毒(west nile virus，WNV)等。YFV是引起黄热病的重要病原，严重时会引起出血热伴随多器官衰竭，尤其是肝、脾、淋巴结、心、肾。
[0004]在1996年时，科学家曾估计每年在非洲和南美洲黄热病毒可引起20万人感染，30万人死亡。近两年，巴西、安哥拉和刚果民主共和国等地发生了黄热病暴发，已造成数百人死亡，死亡率达14％，中国在2016年有11例输入病例。目前，临床上已有减毒疫苗(YFV 17D)，但疫苗短缺和接种率不足导致疾病频繁爆发，非免疫个体仍处于危险之中。在YFV感染后，临床上没有可用于治疗该疾病的有效的特异性药物。
[0005]迄今为止，中和抗体已被证明是治疗病毒性疾病的有效方法，包括人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒和其它黄病毒等。黄病毒表面的E蛋白(Envelope)识别细胞表面的受体，进而促进病毒膜与细胞膜发生膜融合，由三个不同的结构域(DI，DII和DIII)完成这些过程。因此，E蛋白是机体免疫系统产生的中和抗体作用的重要表位。
[0006]已有研究发现有一些人源抗体具有中和活性，可以中和2001年之前的部分黄热病毒毒株，如：5A、7A、R3(27)等可以中和Central African Republic(CAR)1986、Ethiopia 1961、 Senegal1990、Nigeria1987、Ghana 1927(Asibi)和疫苗株YFV 17D。然而，RNA病毒在抗体压力下，具有高突变的特性，尽管已经有些中和抗体被鉴定，但是更多的针对不同表位的新的抗体对于治疗是必不可少的。本专利技术的目的是鉴定特异的具有保护作用的新的YFV中和抗体。

技术实现思路

[0007]为了解决上述问题，本专利技术首先以大肠杆菌表达的YFV
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E蛋白作为抗原，通过流式分选，从一例康复期YFV患者的PBMCs中筛选到可以特异结合YFV
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E蛋白的记忆B细胞，然后对筛选的单一B细胞进行RT
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PCR和PCR扩增，获得6株抗体的可变区片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中。测序正确后，经哺乳动物细胞表达、纯化，进行一系列的功能检测，包括与YFV
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E蛋白的结合力，体外中和效果，体内保护能力等检测。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种抗体，如(1)～(6)任一所示：
[0009](1)抗体命名为YD2，其重链可变区含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
[0010](2)抗体命名为YD25，其重链可变区含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
[0011](3)抗体命名为YD62，其重链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
[0012](4)抗体命名为YD86，其重链可变区含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
[0013](5)抗体命名为YD97
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1，其重链可变区含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；
[0014](6)抗体命名为YD97
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2，其重链可变区含有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体的重链包括重链可变区和重链恒定区，其中重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25，核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体的轻链为κ链，包括轻链可变区和轻链恒定区；轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26，核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，YD2的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:2；YD25的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:4；YD62的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:6；YD86的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:8；YD97
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1的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9 且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10；YD97
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2的重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:11且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:12。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述YD2的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:13、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:14。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述YD25的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:15、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:16。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述YD62的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:17、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:18。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述YD86的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:19、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:20。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述YD97
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1的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:21、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:22。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述YD97
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2的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:23、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:24。
[0024]本专利技术的6个抗体，来源于同一病患者，并且均靶向黄热病毒特有的囊膜蛋白E蛋白，通过抑制E蛋白介导的受体结合和/或膜融合过程，抑制病毒对细胞的感染。
[0025]本专利技术的第二个目的是提供所述抗体在制备药物方面的应用。
[0026]在本专利技术的一种实施方式中，所述药物是用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗体，其特征在于，重链可变区含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链包括重链可变区和重链恒定区；所述重链恒定区含有如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，抗体的轻链为κ链，包括轻链可变区和轻链恒定区；轻链恒定区含有如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：严景华，高福，李燕，马素芳，仵丽丽，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：