本发明专利技术关于生物技术领域，涉及甲基丙二酸血症相关基因的突变位点及其检测方法，本发明专利技术所述的甲基丙二酸血症的相关基因为MMACHC和MMUT，其中甲基丙二酸血症相关基因MMACHC有13种基因位点突变与甲基丙二酸血症相关，所述突变位点为：c.2 T>G、c.2 T>C、c.81+1 G>A、c.395 G>A、c.426 C>A、c.427 C>T、c.429+1 G>C、c.481 C>G、c.481 C>A、c.616del、c.616 C>T、c.617G>C或c.626_627delTG。本发明专利技术通过二代靶向测序检测是否存在这些突变位点，其可以作为预测待测样本是否患有甲基丙二酸血症的筛查方法，为日后研究治疗甲基丙二酸血症的药物提供新的治疗途径。疗途径。
【技术实现步骤摘要】
一种甲基丙二酸血症相关基因MMACHC突变位点及其检测方法
[0001]本专利技术关于生物
，涉及一种甲基丙二酸血症相关基因MMACHC突变位点及其检测方法。
技术介绍
[0002]甲基丙二酸血症(MethylmalonicAciduria,MMA)属常染色体隐性遗传遗传病，是致命的，严重的异质性丙二酸甲酯和钴胺素代谢异常，预后不良所致。MMA患者的发病率和死亡率很高，长期生存的预后很差。其发作期从新生儿期到成年期不等，患病的儿童通常表现出厌食症，肌张力低下，发育迟缓，进行性肾衰竭，功能性免疫功能减退，视神经萎缩和血液学异常。严重者可引起酮症酸中毒、低血糖、高血氨、高甘氨酸血症，在新生儿、婴幼儿期病死率较高。造成这样后果的一个重要原因是MMA的致病突变还未完全清楚，导致患者在未发病时通过基因筛查不能尽早的发现患病风险，因此不能尽早进行干预。
[0003]目前临床上主要检测方法为临床症状结合尿气相色谱质谱检测、血串联质谱检测，需要反复检测或基因检测才能诊断或排除此病。对于检测胎儿是否患病是通过妊娠过程中羊水穿刺进行甲基丙二酸血症(MMA)的产前筛查，它是一项侵入性的操作技术，对于操作人员，环境，孕周等有严格的要求限制。而由于基因检测中现有致病位点的不全面，即现有致病位点大多为发病率较高的致病位点，某些发病率较低或其它导致MMA的突变位点目前不明确，因此会导致假阴性结果。
[0004]目前在临床诊断中检测基因致病位点的方法主要为一代测序，即Sanger测序，此种方法成本高通量低，所需时间较长，检测效率低下。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于克服现有MMA基因突变位点的不完整，提供新的13种MMACHC基因突变，使MMA的基因检测更加准确，检测出MMA的相关的基因突变后，尽早进行干预和治疗。
[0006]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种甲基丙二酸血症相关基因MMACHC突变位点，所述突变位点为：c.2T>G、c.2T>C、c.81+1G>A、c.395G>A、c.426C>A、c.427C>T、c.429+1G>C、c.481C>G、c.481C>A、c.616del、c.616C>T、c.617G>C或c.626_627delTG；
[0008]上述突变点的起始位置和基因序列为：
[0009][0010][0011]一种上述甲基丙二酸血症相关基因突变位点的检测方法，采用二代靶向测序检测。所述的二代靶向测序检测采用二代靶向测序Ion S5
TM
测序仪
[0012]有益效果
[0013](1)本专利技术通过二代靶基因测序技术检测遗传物质是否为突变基因携带者，来评估患甲基丙二酸血症的风险，通过提取出患病新生儿血液中的DNA，利用二代靶基因测序技术检测患者的DNA序列，与健康人的基因进行比对，得出新的13种MMACHC基因位点突变与甲基丙二酸血症相关与甲基丙二酸血症相关。本专利技术扩大MMA了产前筛查的范围，能够在婚前、产前评估MMA患病风险，在最大程度上防止MMA胎儿的出生，具有非常重要的临床意义和社会意义。
[0014](2)本专利技术所述MMACHC基因致病位点均为本专利技术首次发现，所述突变位点在甲基丙二酸血症的筛查和基因诊断中具有潜在的应用前景，上述都基因突变点的发现，为扩大MMA产前筛查的范围，提高检测准确率，为临床资料效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
具体实施方式
[0015]下面结合具体实施实例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：
[0016]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0017]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0018]实施例1
[0019]取济南市妇幼保健院68例已确诊MMA的新生儿外周血2ml，加入抗凝剂采血管中，低温保存送检。
[0020]对于采集的68例血液样本进行检查，低温低速离心后检查是否出现溶血现象。合格的血液样本离心后分层，呈清晰的血浆、中间层和红细胞层。将血浆、中间层和红细胞分别转移至冻存管中，
‑
20℃保存。
[0021]从血液中间层样本中提取DNA试剂盒：TIANamp BloodDNAKit试剂盒。
[0022]DNA文库构建使试剂盒：IonAmpliSeqTM Library KitPlus试剂盒。具体过程如下：
[0023](1)DNA稀释
[0024]1)DNA定量：使用Qubit
TM
dsDNAHSAssay试剂盒进行DNA定量。
[0025]a.将10μl标准品1和2分别加入到2个0.5ml的assay管中，并加入190μl稀释后的dsDNAHS试剂补足200μl，涡旋2～3s，注意不要产生气泡。
[0026]b.取1
‑
20μl待测DNA加入assay管中，并加入相应体积稀释后的dsDNAHS试剂补足200ul，涡旋2～3s，注意不要产生气泡。
[0027]c.室温孵育2min。
[0028]d.使用Qubit 3荧光计测定浓度并记录。
[0029]2)DNA稀释：根据所测得浓度的最小值和最大值，确定PCR体系所需DNA浓度，体系总体积为6μl，DNA含量为1
‑
100ng。根据计算结果取适量DNA加无核酸酶水稀释至6μl。
[0030](2)DNA靶向扩增
[0031]1)准备0.2ml灭菌无酶PCR管，按照表1加入试剂，并吹打混匀。
[0032]表1.DNA靶向扩增组分
[0033][0034]2)按照表2程序进行PCR扩增
[0035]表2.PCR扩增程序
[0036][0037]扩增后产物可在10℃过夜保存，长期保存需在
‑
20℃保存。
[0038](3)部分消化扩增子
[0039]1)将上述20μl体系短暂离心。加入2μl FuPa酶，短暂涡旋、离心。
[0040]2)按照表3程序进行PCR反应。
[0041]表3.FuPa酶消化PCR程序
[0042][0043]可在10℃存放1h，长期保存需存放在
‑
20℃。
[0044](4)连接接头到扩增子
[0045]1)配置接头反应液
[0046]按表4将各组分混合。
[0047]表4.接头反应液组分
[0048][0049]2)进行连接反应
[0050]a.Switch Solutin在室温下化冻溶解。
[0051]b.将步骤(3)的PCR产物短暂离心。
[00本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种甲基丙二酸血症相关基因MMACHC突变位点，其特征在于，所述突变位点为：c.2T>G、c.2T>C、c.81+1G>A、c.395G>A、c.426C>A、c.427C>T、c.429+1G>C、c.481C>G、c.481C>A、c.616del、c.616C>T、c.617G>C或c.626_627delTG；上述突变点的基因序列为：染色体基因突变点突变前序列突变后序列chr1MMACHCc.2T>GGCTATGGGCTAGGGchr1MMACHCc.2T>CGCTATGGGCTACGGchr1MMACHCc.81+1G>ACCAGGCCAGAchr1MMACHCc.395G>...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵燕，韩金祥，崔亚洲，李冕，崔璟怡，邹卉，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：
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