基因疗法DNA载体制造技术

本发明专利技术涉及基因工程，并且可在生物技术、医学和农业中用于制造基因疗法产品。构建基于携带治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，以便于提高人和动物中该治疗性基因的表达水平，所述治疗性基因选自NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、和CGRP基因的组，其中基因疗法DNA载体VTvaf17

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因疗法DNA载体


[0001]本专利技术涉及基因工程，并且可用于生物技术、医学和农业中用于制造基因疗法产品。

技术介绍

[0002]基因疗法是医学中的创新方法，旨在通过将新的遗传物质递送到患者的细胞中以补偿或遏制突变基因的功能和/或治疗遗传障碍来治疗遗传性和获得性疾病。基因表达的终产物可以是RNA分子或蛋白质分子。然而，体内的大多数生理学过程都与蛋白质分子的功能性活性有关，而RNA分子或是蛋白质合成的中间产物，或是进行调节功能。因此，在大多数情况下，基因疗法的目标是向生物体注入基因，所述基因提供由这些基因编码的蛋白质分子的转录和进一步翻译。在本专利技术的描述中，基因表达是指产生具有由该基因编码的氨基酸序列的蛋白质分子。
[0003]基因的组中包含的NOS2、NOS3、KCNMA1、VIP和CGRP基因在人和动物生物体的若干过程中起关键作用。证明了在某些情况下这些蛋白质的低/不足浓度与各种人类疾病之间的相关性，其通过在编码这些蛋白质的正常基因表达中的干扰证实。因此，选自NOS2、NOS3、KCNMA1、VIP、和CGRP基因的组的基因表达的基因疗法上调具有纠正人和动物的各种病况的潜力。
[0004]NOS2基因编码蛋白，即诱导型一氧化氮合酶2(同义名称：NOS2、或NOS2A、或iNOS、或NOS II)。NOS2蛋白参与一氧化氮合成，这反过来是人和动物中许多信号传导途径的介质，包括ERK和Apelin信号传导级联。NOS2在其中发挥重要作用的过程包括不同器官和组织的神经传递、抗细菌和抗肿瘤免疫、和血管舒缩。发现多态性和相对于正常NOS2基因表达的偏差与对不同疾病和病理状况的易感性之间存在联系。
[0005]例如，显示在婴儿中NOS2表达的相对较低水平是STEC溶血性尿毒症综合征(HUS)发病率高的原因之一，导致肾功能衰竭(Tsuji S等人//Tohoku J Exp Med.2012Nov；228(3):247
‑
52)。在体内实验的过程中，刺激一氧化氮合成对Stx诱导的HUS小鼠模型具有保护作用(Dran GI等人//Kidney Int.2002Oct；62(4):1338
‑
48)。在另一项研究中，在NOS2表达降低的小鼠中观察到由败血症导致的死亡的可能性增加(Cobb J等人//Surgery 126(1999)438
‑
442)。
[0006]众所周知，在患有伴随渗出液的中耳炎儿童中观察到腺状肿(adenoids)中NOS2表达降低，并且认为对NOS2表达的诱导是有前景的治疗方法(Granath A等人//Pediatr Allergy Immunol.2010Dec；21(8):1151
‑
6)。
[0007]尽管关于NOS2活性在心血管疾病发病机制中的贡献存在有争议的信息，在对患有实验性高脂血症和易感动脉粥样硬化的兔子的研究中，显示施用表达NOS2基因的重组腺病毒载体导致血管舒缩功能的改善，并且这种方法的防止动脉硬化的作用表现为在血管壁中的脂质积累和内皮细胞中的炎症显著减少(Jiang B等人//Hum Gene Ther.2012Nov；23(11):1166
‑
75)。增加NOS2基因表达(包括通过病毒载体)可以减少或消除血管成形术后的
内膜增生(Barbato JE,Tzeng E.//Trends Cardiovasc Med.2004Oct；14(7):267
‑
72)。
[0008]表明了使用表达增强NOS2基因表达的saRNA的重组腺病毒载体的基因疗法方式恢复大鼠的勃起功能(Wang T等人//J Urol.2013Aug；190(2):790
‑
8)。
[0009]至于癌症，显示了在用表达NOS2的载体注射的小鼠中，肿瘤的生长速度和转移降低(Schwentker A,Billiar TR.//World J Surg.2002Jul；26(7):772
‑
8)。当NOS2被抑制时，针对膀胱癌的BCG疗法的有效性显著降低，并且NOS2表达的增加可以被认为是改善BCG疗法有效性的策略(Shah G等人//Urol Oncol.2014Jan；32(1):45.e1
‑
9)。
[0010]同样，可以将NOS2用于治疗阻塞性肾病(Chevalier RL.//Kidney Int.2004Oct；66(4):1709
‑
10)和骨骼肌损伤(Igamonti E等人//J Immunol.2013Feb 15；190(4):1767
‑
77)。
[0011]NOS3基因编码蛋白，即内皮一氧化氮合酶3(同义名称：NOS3、或eNOS、或NOS III。NOS3蛋白正与NOS2蛋白一样，参与一氧化氮的合成，但特征在于血管内皮细胞中具有组成型表达，并且是确保血管张力的主要因素之一。NOS3参与的主要信号传导级联包括Act和EGF/EGFR信号传导途径。
[0012]显示了伴随表达NOS3基因的载体的引入，在大鼠中观察到高血压降低和高胰岛素血症的缺乏(Zhao CX等人//J Pharmacol Exp Ther.2009Feb；328(2):610
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20)。气管内注射表达NOS3、环前列腺素合酶和VEGF基因的载体导致具有肺动脉高血压的实验动物的肺动脉压降低。用重组的载体转染并表达NOS3的自体细胞的引入获得了类似的阳性结果(Chen等人//Heart Lung Circ.2017May；26(5):509
‑
518；Wei L等人//Hypertens Res.2013May；36(5):414
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21)。
[0013]同样，使用表达NOS3的重组腺病毒载体的基因疗法方式在大鼠中恢复了由年龄相关的变化引起的勃起功能(Bivalacqua T等人//Int J Impot Res.2000Sep；12Suppl 3:S8
‑
17)。
[0014]KCNMA1基因编码蛋白，即细胞膜的钙依赖性钾通道的成孔MaxiK亚基，其主要在平滑肌和神经元兴奋性的功能发挥中起重要作用。还显示了该基因的多态性与各种疾病(特别是心血管疾病)的联系。例如，KCNMA1基因的变异性是发生心肌梗塞和高血压的风险因素(Tabarki B等人//Hum Genet.2016Nov；135(11):1295
‑
1298)。
[0015]KCNMA1基因表达与粘膜的分泌功能相关。显示了构成COPD、哮喘、和可能的肺气肿发病机理的基础的IFN
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γ介导粘液纤毛清除降低可以通过提高KCNMA1基因的表达来校正(Manzanares D等人//Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2014Mar 1；306(5):L453
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与神经传递、抗微生物和抗肿瘤免疫、各种器官和组织的血管舒缩的障碍相关的疾病；用于刺激心肌收缩功能、血管舒张、糖原分解的增加、动脉血压的降低、平滑肌松弛；以及治疗勃起功能障碍，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17的NOS2治疗性基因的编码区，形成具有核苷酸序列SEQ ID No.1的基因疗法DNA载体VTvaf17
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NOS2。2.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与神经传递、抗微生物和抗肿瘤免疫、各种器官和组织的血管舒缩的障碍相关的疾病；用于刺激心肌收缩功能、血管舒张、糖原分解的增加、动脉血压的降低、平滑肌松弛；以及治疗勃起功能障碍，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17的NOS3治疗性基因的编码区，形成具有核苷酸序列SEQ ID No.2的基因疗法DNA载体VTvaf17
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NOS3。3.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与神经传递、抗微生物和抗肿瘤免疫、各种器官和组织的血管舒缩的障碍相关的疾病；用于刺激心肌收缩功能、血管舒张、糖原分解的增加、动脉血压的降低、平滑肌松弛；以及治疗勃起功能障碍，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17的VIP治疗性基因的编码区，形成具有核苷酸序列SEQ ID No.3的基因疗法DNA载体VTvaf17
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VIP。4.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与神经传递、抗微生物和抗肿瘤免疫、各种器官和组织的血管舒缩的障碍相关的疾病；用于刺激心肌收缩功能、血管舒张、糖原分解的增加、动脉血压的降低、平滑肌松弛；以及治疗勃起功能障碍，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17的KCNMA1治疗性基因的编码区，形成具有核苷酸序列SEQ ID No.4的基因疗法DNA载体VTvaf17
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KCNMA1。5.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与神经传递、抗微生物和抗肿瘤免疫、各种器官和组织的血管舒缩的障碍相关的疾病；用于刺激心肌收缩功能、血管舒张、糖原分解的增加、动脉血压的降低、平滑肌松弛；以及治疗勃起功能障碍，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17的CGRP治疗性基因的编码区，形成具有核苷酸序列SEQ ID No.5的基因疗法DNA载体VTvaf17
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CGRP。6.根据权利要求1、2、3、4、或5所述的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，其携带NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、或CGRP治疗性基因，所述基因疗法DNA载体由于如下的实情是独特的，即每种构建的基因疗法DNA载体：根据权利要求1、2、3、4、或5所述的VTvaf17
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NOS2、或VTvaf17
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NOS3、或VTvaf17
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VIP、或VTvaf17
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KCNMA1、或VTvaf17
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CGRP由于VTvaf17载体部分不超过3200bp的有限大小而具有有效渗入人和动物细胞并表达克隆到其中的NOS2、或NOS3、或VIP、或KCNMA1、或CGRP治疗性基因的能力。7.根据权利要求1、2、3、4、或5所述的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，其携带NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、或CGRP治疗性基因，所述基因疗法DNA载体由于如下的实情是独特的，即每种构建的基因疗法DNA载体：根据权利要求1、2、3、4、或5所述的VTvaf17
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NOS2、或VTvaf17
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NOS3、或VTvaf17
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VIP、或VTvaf17
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KCNMA1、或VTvaf17
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CGRP使用核苷酸序列，所述核苷酸序列不是抗生素抗性基因、病毒基因，或作为结构元件的病毒基因组调控元件，从而确保其安全用于人和动物的基因疗法。8.根据权利要求1、2、3、4、或5所述的携带NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、CGRP治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的生产方法，所述方法涉及如下获得基
因疗法DNA载体中的每一种：VTvaf17
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NOS2、或VTvaf17
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NOS3、或VTvaf17
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VIP、或VTvaf17
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KCNMA1、或VTvaf17
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CGRP：将NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、CGRP治疗性基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17中，并且分别获得基因疗法DNA载体VTvaf17
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NOS2，SEQ ID No.1；或VTvaf17
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NOS3，SEQ ID No.2；或VTvaf17
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VIP，SEQ ID No.3；或VTvaf17
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KCNMA1，SEQ ID No.4；或VTvaf17
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CGRP，SEQ ID No.5，其中所述NOS2、或NOS3、或VIP、或KCNMA1、或CGRP治疗性基因的编码区通过如下获得：通过从人生物学组织样本分离总RNA，随后使用所获得的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增，并通过相应的限制性内切核酸酶切割扩增产物，其中通过SalI和KpnI、或BamHI和EcoRI限制位点进行对基因疗法DNA载体VTvaf17的克隆，其中在无抗生素的情况下进行选择，其中出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17
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NOS2，SEQ ID No.1产生过程中用于反转录反应和PCR扩增：NOS2_F ATCGTCGACCACCATGGCCTGTCCTTGGAAATTTC，NOS2_R CGGTACCTCAGAGCGCTGACATCTCCAGG，并且通过SalI和KpnI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将NOS2基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17，其中出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17
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NOS3，SEQ ID No.2产生过程中用于反转录反应和PCR扩增：NOS3_F GACAAGCTTCCACCATGGGCAACTTGAAGAG，NOS3_R GGAATTCAGGGGCTGTTGGTGTCTGAGCCG，并且通过HindIIII和EcoRI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将NOS3基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17，其中出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17
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VIP，SEQ ID No.3产生过程中用于反转录反应和PCR扩增：VIP_F AGGATCCACCATGGACACCAGAAATAAGGCCCAG，VIP_R GGAATTCATTTTTCTAACTCTTCTGGAAAG，并且通过BamHI和EcoRI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将VIP基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17，其中出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17
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KCNMA1，SEQ ID No.4产生过程中用于反转录反应和PCR扩增：KCNMA1_F AGGATCCGGTACCGAGGAGATCTGCCGCCGCGATCGCCATG，KCNMA1_R ACCAAGCTTATCTGTAAACCATTTCTTTTCTG，并且通过BamHI和EcoRI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将KCNMA1基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17，其中出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17
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CGRP，SEQ ID No.5产生过程中...

【专利技术属性】
技术研发人员：N萨韦利瓦，
申请(专利权)人：普罗里夫涅创新技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：