基因疗法DNA载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程，并且可以在生物技术、医学和农业中用于制造基因疗法产品。构建携带治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，以提高人和动物中该治疗性基因的表达水平，所述治疗性基因选自KRT5、KRT14、LAMB3、和COL7A1基因的组，其中基因疗法DNA载体VTvaf17

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因疗法DNA载体及其应用
[0001]携带选自KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因的组的治疗性基因以提高这些治疗性基因的表达水平的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，其生产和使用方法，携带基因疗法DNA载体的大肠杆菌菌株SCS110
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AF/VTvaf17
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KRT5、或大肠杆菌菌株SCS110
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AF/VTvaf17
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KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110
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AF/VTvaf17
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LAMB3、或大肠杆菌菌株SCS110
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AF/VTvaf17
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COL7A1，其产生方法，在工业规模上基因疗法DNA载体的生产方法。


[0002]本专利技术涉及基因工程，并且可在生物技术、医学和农业中用于制造基因疗法产品。

技术介绍

[0003]基因疗法是医学中的创新方法，旨在通过将新的遗传物质递送到患者的细胞中以补偿或遏制突变基因的功能和/或治疗遗传障碍(disorder)来治疗遗传性和获得性疾病。基因表达的终产物可以是RNA分子或蛋白质分子。然而，体内的大多数生理学过程都与蛋白质分子的功能性活性有关，而RNA分子或是蛋白质合成的中间产物，或是进行调节功能。因此，在大多数情况下，基因疗法的目标是向生物体注入基因，所述基因提供由这些基因编码的蛋白质分子的转录和进一步翻译。在本专利技术的描述中，基因表达是指产生具有由该基因编码的氨基酸序列的蛋白质分子。
[0004]一组基因中包含的KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因在人和动物体的若干过程中起关键作用。证明了在某些情况下这些蛋白质的低/不足浓度与各种人类疾病之间的相关性，其通过在编码这些蛋白质的正常基因表达中的干扰证实。因此，选自KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因的组的基因表达增加的基因疗法具有纠正人和动物中的各种病症的潜力。
[0005]COL7A1基因编码VII型胶原。三条前α1(VII)链缠绕在一起形成三链体前胶原分子。前胶原分子由细胞分泌，并且被酶加工从末端移除额外的蛋白质片段。一旦这些分子被加工，它们将自身排列成成熟的VII型胶原的细长束。
[0006]COL7A1基因中的突变导致营养不良性大疱性表皮松解症(dystrophic epidermolysis bullosa)。水疱最常发生在轻微受伤的部位，如肘部伸肌面和手足背。愈合导致疤痕，浅表表皮囊肿和色素沉着。有些患者具有指甲营养不良。经常发生真皮外表现，包括对泌尿道和胃肠道，外眼膜的损伤，慢性贫血，骨质疏松和生长迟缓。大疱性表皮松解症患者有高的癌症风险，特别是形成侵袭性鳞状细胞癌。于1978年在英国成立的DEBRA International在全球范围内研究和治疗大疱性表皮松解症。根据DEBRA International，世界上每5
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10万人产生一名患者。
[0007]目前世界范围内对大疱性表皮松解症的治疗以三个方向进行各种研究：基因疗法、重组蛋白疗法和基于细胞的疗法(干细胞应用)。所有这些类型的治疗都处于不同的发展阶段。
[0008]治疗大疱性表皮松解症的基因疗法方法包括不同的实验性治疗。在纠正COL7A1基因突变的若干研究中，成功地使用了离体基因组编辑技术(Menc
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a等人，2018)、编码COL7A1
基因的线性DNA分子的微注射(Mecklenbeck等人，2002)、使用整合酶的cDNA整合(Ortiz
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Urda等人，2003)、慢病毒载体的皮内注射(Woodley等人，2004)、基于TALEN核酸酶的突变修复技术(Osborn等人，2013)，以及注射自体细胞，即使用各种反转录病毒载体修饰的成纤维细胞或角质形成细胞(Jack
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w等人，2016，Georgiadis等人，2016，Goto等人，2006)。目前，这些方法的临床试验处于不同的研究阶段(NCT01263379,NCT02810951)。
[0009]KRT5和KRT14基因分别编码角蛋白5和角蛋白14蛋白。角蛋白是一组刚性纤维蛋白，其决定皮肤、毛发和指甲的结构。角蛋白5在角质形成细胞中产生。角蛋白5与角蛋白14形成称为角蛋白中间细丝的分子。这些细丝被收集成网状结构，为角质形成细胞的附着和表皮与下层皮肤层之间的连接所必需。角蛋白中间细丝网络为皮肤提供强度和弹性，并保护皮肤免受由摩擦和其他机械应力所致的的损害。KRT5和KRT14中的突变导致约75％的大疱性表皮松解症病例，并且疾病的严重程度取决于基因突变的区域(Bolling、Lemmink、Jansen和Jonkman，2011；Pfendner等人，2016)。在KRT5基因敲除小鼠中，真皮和表皮之间完全缺乏连接(Cao等人，2001；Peters、Kirfel、B
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ssow、Vidal和Magin，2001)。
[0010]除了大疱性表皮松解症之外，KRT5和KRT14基因中的突变还导致诸如网状色素性屈曲异常(reticulate pigmented anomaly of the flexures)(道林
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德戈斯二氏病(Dowling
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Degos disease))、网状色素性皮肤病(reticular pigmented dermatopathy)(Oberst
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Lehn
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Hauss色素性皮肤病(Oberst
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Lehn
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Hauss pigmented dermatopathy))、Naegeli
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Franceschetti
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Jadassohn综合征(Coulombe PA等人，2017)的疾病。
[0011]LAMB3基因编码层粘连蛋白β3(即层粘连蛋白亚基)。层粘连蛋白是一组调节细胞生长、运动和粘附的蛋白质。它们还参与基底膜的形成和构造(organization)，所述基底膜构成薄片状结构，它们在许多组织中分离和支持细胞。层粘连蛋白是连接基底膜两层并帮助形成单一皮肤结构的称为锚定细丝的纤维的主要成分，并且LAMB3基因中的突变导致大疱性表皮松解症。研究表明层粘连蛋白还具有其他若干功能。这种蛋白似乎在伤口愈合和釉质发生(enamel genesis)中是重要的。
[0012]从文献中已知，LAMB3基因中的突变可引起遗传性棕色釉质(hereditary brown enamel)(Poulter等人，2014)，并且该基因的一些罕见等位基因与疼痛性脂肪过多症(lipomatosis dolorosa)和2型糖尿病风险相关(Jiao H等人，2016)。
[0013]对一名患有大疱性表皮松解症的自愿患者的实验性工作表明，用表达LAMB3基因的反转录病毒载体转染的细胞的移本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与皮肤、毛发和指甲结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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德戈斯二氏病、Oberst
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Lehn
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Hauss色素性皮肤病、Naegeli
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Franceschetti
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Jadassohn综合征和棕色釉质，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的KRT5治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列SEQ ID No.1的4929bp基因疗法DNA载体VTvaf17
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KRT5。2.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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德戈斯二氏病、Oberst
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Lehn
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Hauss色素性皮肤病、Naegeli
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Franceschetti
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Jadassohn综合征和棕色釉质，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的KRT14治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列SEQ ID No.2的4575bp基因疗法DNA载体VTvaf17
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KRT14。3.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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德戈斯二氏病、Oberst
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Lehn
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Hauss色素性皮肤病、Naegeli
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Franceschetti
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Jadassohn综合征和棕色釉质，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的LAMB3治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列SEQ ID No.3的6674bp的基因疗法DNA载体VTvaf17
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LAMB3。4.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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德戈斯二氏病、Oberst
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Lehn
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Hauss色素性皮肤病、Naegeli
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Franceschetti
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Jadassohn综合征和棕色釉质，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的COL7A1治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列SEQ ID No.4的11990bp的基因疗法DNA载体VTvaf17
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COL7A1。5.根据权利要求1、2、3或4所述的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，其携带KRT5、KRT14、LAMB3或COL7A1治疗性基因，所述基因疗法DNA载体由于如下的实情是独特的，即每种构建的基因疗法DNA载体：根据权利要求1、2、3或4所述的VTvaf17
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KRT5、或VTvaf17
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KRT14、或VTvaf17
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LAMB3、或VTvaf17
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COL7A1由于VTvaf17载体部分不超过3200bp的有限大小而具有有效渗入人和动物细胞并表达克隆至其中的KRT5、或KRT14、或LAMB3、或COL7A1治疗性基因的能力。6.根据权利要求1、2、3或4所述的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，其携带KRT5、KRT14、LAMB3或COL7A1治疗性基因，所述基因疗法DNA载体由于如下的实情是独特的，即每种构建的基因疗法DNA载体：根据权利要求1、2、3或4所述的VTvaf17
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KRT5、或VTvaf17
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KRT14、或VTvaf17
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LAMB3、或VTvaf17
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COL7A1使用核苷酸序列作为结构元件，所述核苷酸序列不是抗生素抗性基因、病毒基因或病毒基因组调控元件，从而确保其安全用于人和动物的基因疗法。7.根据权利要求1、2、3或4所述的携带KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的产生方法，所述方法涉及如下获得基因疗法DNA载体中的每一种：VTvaf17
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KRT5、或VTvaf17
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KRT14、或VTvaf17
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LAMB3、或VTvaf17
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COL7A1：将根据权利要求1、2、3或4中所述的KRT5、或KRT14、或LAMB3、或COL7A1治疗性基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，并且分别获得基因疗法DNA载体VTvaf17
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KRT5，SEQ ID No.1、或VTvaf17
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KRT14，SEQ ID No.2、或VTvaf17
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LAMB3，SEQ ID No.3、或VTvaf17
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COL7A1，SEQ ID No.4，其中所述KRT5、或KRT14、或LAMB3或COL7A1治疗性基因的编码区如下获得：通过从人生物组织样本中分离总RNA，然后使用获得的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增，并通过相应的限制性内切酶切割扩增产物，其中通过BamHII和HindIII、或SalI和EcoRI限制位点进行对所述基因疗法DNA载体VTvaf17的克隆，其中在无抗生素的情况下进行选择，其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17
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KRT5，SEQ ID No.1生产过程中用于所述反转录反应和PCR扩增：KRT5_FTTTGGATCCACCATGTCTCGCCAGTCAAGTGTGTCCTTC，KRT5_RAATAAGCTTCTAGCTCTTGAAGCTCTTCCGGGAGG，并且通过BamHII和HindIII限制性内切酶进行扩增产物的切割和将KRT5基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17
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KRT14，SEQ ID No.2生产过程中用于所述反转录反应和PCR扩增：KRT14_FTTTGGATCCACCATGACCACCTGCAGCCGCCAG，KRT14_RAATAAGCTTTCAGTTCTTGGTGCGAAGGACCTGC，并且通过BamHII和HindIII限制性内切酶进行扩增产物的切割和将KRT14基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17
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LAMB3，SEQ ID No.3生产过程中用于所述反转录反应和PCR扩增：LAMB3_FTTAGTCGACCACCATGAGACCATTCTTCCTCTTG，LAMB3_RATAGAATTCACTTGCAGGTGGCATAGTAGAG，并且通过SalI和EcoRI限制性内切酶进行扩增产物的切割和将LAMB3基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17
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COL7A1，SEQ ID No.4生产过程中用于所述反转录反应和PCR扩增：COL7A1_FATCGTCGACCACCATGACGCTGCGGCTTCTGGT，COL7A1_R ATAGAATTCAGTCCTGGGCAGTACCTGTC，并且通过SalI和EcoRI限制性内切酶进行扩增产物的切割和将COL7A1基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中。8.使用根据权利要求1、2、3或4所述的携带KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体用...

【专利技术属性】
技术研发人员：N萨韦利瓦，
申请(专利权)人：普罗里夫涅创新技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：