一种牛抗菌肽基因Cath及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种牛抗菌肽基因Cath及其制备方法和该基因在制备畜禽抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用，所述的牛抗菌肽基因Cath具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明专利技术使用毕赤酵母重组表达Caht，使得目的重组Caht基因在获得翻译后修饰加工，因此更接近牛体内表达的Caht蛋白；Caht基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；本发明专利技术表达的Caht基因具有良好的抑菌作用，含有该基因的酵母菌含有动物生长发育所必需的各种营养物质，可作为优质蛋白质源添加到牛、羊、鸡、猪、水产等饲料中。产等饲料中。产等饲料中。

【技术实现步骤摘要】
一种牛抗菌肽基因Cath及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，特别涉及一种牛抗菌肽基因Cath及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]自2020年7月1日我国全民实施禁抗令以来，“如何替抗”已经成为了行业的新常态。抗菌肽、噬菌体、抗体、微生态制剂、植物提取物、酸化剂、酶制剂、寡糖、酵母培养物和发酵饲料等，都有一定的抗生素替代效果。在饲料中全面禁止添加抗生素，对于中国来说，既容易但又很不容易。在有条件时使用抗生素替代物，改善养殖场的生物安全，并通过改良卫生条件和动物福利来预防感染，而当前科研的成果在现阶段还难以满足养殖业的全面需求。全面禁抗的执行，以抗生素的替代品而言，抗菌肽具有显著的抗菌、抗病毒及抗原虫生物活性。抗菌肽主要作用于病原微生物的细胞膜，在细胞膜上形成离子通道，破环其完整性并产生穿孔现象，造成病原微生物内容物溢出而死亡。
[0003]本专利技术的目的是将Caht基因导入毕赤酵母中进行表达，制备用作为禽畜水产饲料添加剂，代替目前禽畜水产饲料中使用的抗生素，以达到既可预防和治疗动物疾病，又可减少滥用素带来的不良后果的目的。重组表达纯化的牛抗菌肽基因Caht蛋白具有一定的抑菌作用以及抗原性，期望能将牛抗菌肽应用于生产抗菌药物、疫苗或饲料添加剂等，将在牛、羊养殖业乃至畜禽水产养殖业越发产生重大作用。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供的牛抗菌肽基因Caht具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
[0005]同时本专利技术还提供了一种含有上述牛抗菌肽基因Cath的表达载体；所述的表达载体是通过将牛抗菌肽基因Cath核酸表达序列连接到酵母表达载体pPIC9K的 EcoR1 位点和Not1位点之间，从而得到的表达载体pPIC9K
‑
Cath。
[0006]同时本专利技术还提供了上述牛抗菌肽基因Cath编码的Cath重组蛋白，所述的Cath重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0007]同时同时，本专利技术还提供了所述的Cath重组蛋白的应用，用于制备畜禽抗菌药物、疫苗或饲料添加剂。
[0008]同时本专利技术还提供了所述的牛抗菌肽基因Cath的制备方法，包括以下步骤：（1）提取牛血液总RNA，经mRNA纯化及反转录得cDNA；（2）设计引物：利用PCR方法扩增编码基因，获得所述Cath的编码基因或其变体；所述引物包括如：SEQ ID NO:3所示上游引物和如SEQ ID NO:4所示下游引物。
[0009]本专利技术使用毕赤酵母重组表达Caht，与大肠杆菌表达相比，利用酵母表达蛋白在生产实践上具有诸多优势。一是毕赤酵母具有生物的来细胞结构，具有糖酰化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能，其表达产物更接近动物体内的蛋白。二是外源蛋白基
因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失，表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达，表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化。三是酵母菌含有动物生长发育所必需的各种营养物质，可作为优质蛋白质源添加到鸡、猪、反刍、水产等饲料中。
[0010]本专利技术的有益效果如下：1、本专利技术提供的牛抗菌肽基因Caht可应用于制备畜禽水产饲料添加剂或抗病药物的开发，同时可以应用于免疫细胞化学研究、肿瘤诊断评价等方面，有效的代替了抗生素的使用，促进了畜禽养殖产业的健康发展。
[0011]2、本专利技术的重组表达方法使得目的重组Caht基因在获得翻译后修饰加工，因此更接近牛体内表达的Caht蛋白；Caht基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；Caht表达水平高，既可在胞内表达，又可分泌型表达，重组蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化。
[0012]3、本专利技术表达的Caht基因的酵母菌含有动物生长发育所必需的各种营养物质，可作为优质蛋白质源添加到牛、羊、鸡、猪、水产等饲料中。
[0013]4、本专利技术制备的表达菌株以及其表达的Caht具有良好的抑菌作用，可应用于生产牛、羊等畜禽抗菌药物、疫苗或饲料添加剂。
附图说明
[0014]图1是本专利技术采用的酵母表达载体pPIC9K质粒图谱。
[0015]图2是本专利技术pPIC9K
‑
Cath 质粒构建图。
[0016]图3是本专利技术pPIC9K
‑
Cath序列比对结果。
[0017]图4是本专利技术pPIC9K
‑
Cath质粒酶切电泳检测。
[0018]图5是本专利技术pPIC9K
‑
Cath质粒线性化分析图。
[0019]图6是本专利技术pPIC9K
‑
Cath转化平板图。
[0020]图7是本专利技术pPIC9K
‑
Cath基因组提取结果图。
[0021]图8是本专利技术pPIC9K
‑
Cath蛋白SDS
‑
PAGE纯化分析。
[0022]图9是本专利技术pPIC9K
‑
Cath蛋白Western Blot鉴定分析。
[0023]图10是本专利技术Caht蛋白的金黄色葡萄球菌抑菌效果检验。
[0024]图11是本专利技术Caht蛋白的大肠杆菌抑菌效果检验。
[0025]图12是实施例5各组小鼠粪便肠杆菌平板计数培养的结果图。
[0026]图13是实施例5各组小鼠粪便总肠杆菌数的对比图。
具体实施方式
[0027]下面结合附图对本专利技术作进一步说明。
[0028]下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》（Sambrook, J., Russell, David W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd edition, 2001,NY, Cold Spring Harbor）。
[0029]所用引物及DNA序列均由华大基因（深圳）科技有限公司合成。
[0030]牛血液样品：取自健康成年牛，通过无菌采取外周血全血，置于RNAlater液(美国ANBIN公司)中
‑
80℃保存备用。
[0031]实施例11、总RNA提取：使用TRIzol reagent试剂从牛血液提取总RNA并混合；利用NanoDrop 1000 spectrophotometer 和 Agilent 2100 Bioanalyzer检测提取总RNA的质量以及完整性，具体方法参照说明书。
[0032]2、Caht基因完整核苷酸序列（EST）的获取：从NCBI数据获取Caht基因序列（GenBank: CAH23217.1）信息，设计Caht蛋白编码区扩增引物，在引物的5
′
端设计了酶切位点及保护性碱基；然后以牛血液总RNA为模板，使用oligo(dT)引物将牛血液总RNA经逆转录获取本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛抗菌肽基因Cath，其特征在于：所述的牛抗菌肽基因Cath的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种如权利要求1所述的牛抗菌肽基因Cath编码的Cath重组蛋白，其特征在于：所述的Cath重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。3.一种表达载体，其特征在于：所述的载体含有权利要求1所述的牛抗菌肽基因Cath；所述的载体是通过将牛抗菌肽基因Cath核酸表达序列连接到酵母表达载体pPIC9K的EcoR1 位点和Not1位点之间，从而得到的表达载体pPIC9K
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：马春霞，李军，贺会利，钟舒红，冯世文，吴翠兰，彭昊，陶立，李常挺，李小宁，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：