一种P-Tau蛋白化学发光检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种P

【技术实现步骤摘要】
一种P
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Tau蛋白化学发光检测试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术属于生化检测
，具体涉及一种用于P
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Tau蛋白定性定量化学发光检测试剂盒及其制备方法。

技术介绍

[0002]Tau蛋白又称微管结合蛋白（Microtubulue Association Protein，MAP），存在于正常脑组织神经元轴突中，具有合成和稳定神经元细胞骨骼的作用。正常脑中Tau蛋白的细胞功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管；与形成的微管结合，维持微管稳定性，降低微管蛋白分子的解离，并诱导微管成束。正常脑中Tau蛋白分子含2
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3个磷酸基，而阿尔茨海默症（AD）患者脑中的Tau蛋白则异常过度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5
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9个磷酸基，并丧失正常生物功能。
[0003]有研究表明AD致病的主要原因是由于大脑中Tau蛋白过度磷酸化导致神经纤维缠结和大脑中β淀粉样蛋白大量沉积构成老年斑，进而导致神经元功能异常，Tau蛋白过度磷酸化是AD脑神经元降解的重要初始步骤。有研究表明，AD患者大脑中Tau蛋白过度磷酸化产生的P
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Tau
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181蛋白可启动血脑屏障外的P
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Tau
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181蛋白的生成，最终导致血液中P
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Tau
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181含量的增加。因此，检测血清中P
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Tau
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181蛋白的含量对诊断AD有着较高的临床价值。
[0004]目前已知的P
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Tau蛋白检测方法主要有放射免疫测定法（RIA）、均相酶免疫检测法、酶联免疫法（ELISA）、高效液相色谱法、气相色谱法和气相色谱和质谱联用法（GC
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MS）。
[0005]放射免疫测定法，试剂的半衰期段，污染大，费用较高，需要用专门的设备，有时会出现交叉反应、假阳性反应，组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐及pH有时会影响结果。
[0006]酶联免疫法，目前市面上已有通过CFDA认证的市售检测试剂盒，深圳市安群生物工程有限公司的“磷酸化Tau
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181蛋白测定试剂盒(化学发光法)”，该试剂盒采用双抗体夹心法，血清标本加到包被有P
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Tau
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181抗体的微孔板上，存在于标本中的P
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Tau
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181与板上的抗体结合，通过洗板，将未结合的游离成分洗去；加入P
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Tau
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181的多抗（结合抗体），温育后洗涤，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗（酶结合物），最终形成一个抗体／抗原／抗体/酶标二抗的复合物，加入显色剂显色，一段时间后终止反应，在450nm处测OD值，OD值随标本中P
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Tau
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181浓度的增加而升高，根据校准品绘制的标准曲线即可算出标本中P
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Tau
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181的含量。该试剂盒操作步骤烦琐，易出错，实验耗时4个小时以上，特异性较差，经常会出现假阳性、假阴性的结果判读。
[0007]色谱法检测蛋白目前商品化非常少，因需要专业的设备，且灵敏度低，只在实验室分析应用较多。
[0008]目前，已有的P
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Tau蛋白检测方法或多或少都存在如试剂检测成本高、操作复杂、易产生污染、产生一定的假阴性和假阳性等缺陷。因此，开发一种污染小、灵敏度高、操作简单、成本低的P
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Tau蛋白快速定量检测方法亟不可待，这对阿尔兹海默症患者早期诊断具有重要意义。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是提供一种定量检测P
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Tau蛋白的磁微粒化学发光试剂盒，所述试剂盒采用化学发光免疫双抗体夹心法对血清中P
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Tau蛋白进行定量检测。
[0010]本专利技术通过以下技术方案实现实现定量检测P
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Tau蛋白的目的。
[0011]第一方面，本专利技术提供一种P
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Tau蛋白检测试剂盒，所述试剂盒包括包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球、ABEI标记的第一株抗体、FITC标记的第二珠抗体、P
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Tau蛋白标准品、质控品和浓缩洗液，所述第一株抗体和第二株抗体为抗P
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Tau蛋白的单克隆抗体，且所述第一株抗体所识别的P
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Tau蛋白的氨基酸位点序列如SEQ ID:1所示，所述第二株抗体所识别的P
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Tau蛋白的氨基酸位点序列如SEQ ID:2所示。
[0012]SEQ ID:1 MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYTSEQ ID:2 MHQDQEGDTDAGLKESPLQT PTEDGSEEPG SETSDAKSTP TAEDVTAPLV DEGAPGKQAAABEI标记的第一株抗体和FITC标记的第二珠抗体均保存于含有5
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8%（w/v）牛血清蛋白，0.2%（w/v）NaN3的PBS缓冲液中，ABEI标记的第一株抗体浓度为0.3
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1.5μg/mL，FITC标记的第二珠抗体浓度为1.0
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3.0μg/mL。
[0013]P
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Tau蛋白标准品是P
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Tau蛋白浓度为0.00 ng/mL、2.00 ng/mL、6.00 ng/mL、30.00 ng/mL、150.00 ng/mL、300.00 ng/mL，含有5
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8%（w/v）牛血清蛋白，0.2%（w/v）NaN3的PBS缓冲液。
[0014]质控品为含有5
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8%（w/v）牛血清蛋白，0.2%（w/v）NaN3的PBS缓冲液。
[0015]浓缩洗液是0.6%（W/V）TRIS缓冲液，使用时将浓缩洗液稀释15倍使用。
[0016]所述包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球保存于含有0.2%（w/v）NaN3的TRIS缓冲液中，包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球浓度为0.05
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0.20%（v/v）。
[0017]本专利技术所述的高分散磁性微球通过如下方法制备得到：首先采用多臂聚乙二醇
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氨基对磁性微球本体进行化学修饰，再将含羧基的线性高分子聚合物共价偶联到前述经化学修饰的磁性微球表面。
[0018]所述含羧基的线性高分子聚合物分子量为3000
‑
8000，选自透明质酸、聚丙烯酸、马来酸丙烯酸共聚物中的一种或两种以上的组合。
[0019]优选的，所述含羧基的线性高分子聚合物为透明质酸。
[0020]所述多臂聚乙二醇
‑
氨基为通式Ⅰ所示的化合物：其中，R选自季戊四醇或聚季戊四醇、丙三醇或聚丙三醇，n为臂数，n为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种P
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Tau蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球、ABEI标记的第一株抗体、FITC标记的第二珠抗体、P
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Tau蛋白标准品、质控品和浓缩洗液，所述第一株抗体和第二株抗体为抗P
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Tau蛋白的单克隆抗体，且所述第一株抗体所识别的P
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Tau蛋白的氨基酸位点序列如SEQ ID:1所示，所述第二株抗体所识别的P
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Tau蛋白的氨基酸位点序列如SEQ ID:2所示。2.根据权利要求1所述的P
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Tau蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球保存于含有0.2%（w/v）NaN3的TRIS缓冲液中，浓度为0.05
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0.20%（v/v）。3.根据权利要求1所述的P
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Tau蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述的高分散磁性微球通过如下方法制备得到：首先采用多臂聚乙二醇
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氨基对磁性微球本体进行化学修饰，再将含羧基的线性高分子聚合物共价偶联到前述经化学修饰的磁性微球表面。4.根据权利要求3所述的P
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Tau蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述含羧基的线性高分子聚合物分子量为3000
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8000，选自透明质酸、聚丙烯酸、马来酸丙烯酸共聚物中的一种或两种以上的组合。5.根据权利要求3所述的P
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Tau蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述多臂聚乙二醇
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氨基为通式Ⅰ所示的化合物：其中，R选自季戊四醇或聚季戊四醇、丙三醇或聚丙三醇，n为臂数，n为≥3的整数，1≤k≤n。6.根据权利要求5所述的P
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Tau蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述多臂聚乙二醇
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氨基为如式Ⅱ所示的三臂聚乙二醇
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氨基，或者如式Ⅲ所示的四臂聚乙二醇
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氨基，PEG分子量为400
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2000，（Ⅱ）、
ꢀꢀ
（Ⅲ）。7.根据权利要求3所述的P
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Tau蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述高分散磁性微球的制备方法包括如下步骤：（1）将磁性微球本体分散于质量浓度为10
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30%多臂聚乙二醇
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氨基水溶液中，40
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45℃反应1
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4小时，用蒸馏水清洗磁性微球后分散于pH7.4的PBS中...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾亚平，赖楚明，
申请(专利权)人：深圳市天大生物医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：