一种使用化学放光方法检测人类VEGF-A浓度的生物分析方法技术

本发明专利技术公开了一种使用化学放光方法检测人类VEGF

【技术实现步骤摘要】
一种使用化学放光方法检测人类VEGF
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A浓度的生物分析方法


[0001]本专利技术涉及生物分析检测领域，具体涉及通过双抗体夹心法，采用化学发光的检测方式检测人类基质中VEGF
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A浓度的方法。

技术介绍

[0002]血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是在血管生成过程中是一种发挥重要作用的细胞因子。VEGF家族包含VEGF
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A,VEGF
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B,VEGF
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C,VEGF
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D和VEGF
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E,还有胎盘生长因子(PIGF)。VEGF
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A有着多样的生理学活性，包括促进内皮细胞的增殖和转移，促进蛋白水解，促进微血管渗漏，所有的这些作用均促进血管生成。VEGF
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A通过结合VEGFR
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1和VEGFR
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2发挥生理学作用。在炎症条件和糖缺乏的情况下低氧能够诱导VEGF
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A的表达。发炎和血管化的眼角膜中VEGF
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A会上调表达。肿瘤的血管生成中VEGF
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A也起到了关键的作用，多种人类的癌症中VEGF
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A的受体VEGFR上调，在体内VEGF
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A的抗体能够有效的抑制肿瘤的生长。综上VEGF
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A在视网膜疾病中是主要的靶点，且是肿瘤治疗的重要靶点，目前上市的抗VEGF
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A的药物包含aflibercept，bevacizumab，ramucirumab，Conbercept等。
[0003]在多种肿瘤病人中发现了VEGFs浓度的上调，特别在转移性的肿瘤中VEGF
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A的浓度有显著的提升,VEGF
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A的浓度和多种肿瘤疾病的预后也有相关性。在湿性年龄相关性黄斑变性的眼科疾病中(wet
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AMD),VEGF
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A被认为眼部血管非正常生长和黄斑泄露的进程中扮演可关键的角色。血清和血浆中VEGF
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A的浓度测定是肿瘤疾病病人和wet
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AMD病人药物治疗预前预后的重要参考指标。目前用于VEGF
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A浓度的生物分析方法以受体配体结合原理的ELISA检测方法，多以试剂盒的形式存在如ELISA方法R&D systems Cat.DVE00或者电化学发光检测方法MSD Cat.K151UVK等。
[0004]尽管VEGF
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A的浓度测定方法市场上已有试剂盒可以提供，但是性能上仍然有没有满足的需求。有资料记载测得VEGF的浓度在血清样本中要远远高于血浆样品，血清样本中VEGF测得浓度为76to 854pg/mL，而相对应的枸橼酸钠抗凝的血浆样品VEGF测得浓度为9
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42pg/mL，结果差异非常大，经研究发现血液中的血小板释放VEGF是血清样品较血浆样品VEGF增加的主要原因。对于血液中循环的VEGF
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A的浓度测定使用枸橼酸钠抗凝的血浆样品进行测定相对于使用血清样品将会是更合适的选择。由于枸橼酸钠抗凝的血浆样品中VEGF
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A的浓度较低，对于检测方法的灵敏度要求较高，而常规的ELISA试剂盒如R&D systems Cat.DVE00在血清血浆中的检测下限为31.3pg/mL，无法满足检测的需求。电化学发光检测方法MSD Cat.K151UVK在血清血浆中的检测下限为2pg/mL，能够满足需求，但是整个试剂盒成本非常高，且配套使用的仪器价格高昂，相对于ELISA试剂盒多种选择，MSD电化学发光检测方法具有垄断地位，没有可替换的产品可供选择，一旦采购周期太长或者断货，不利于VEGF
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A的浓度测定临床检测业务的持续进行。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的提供一种使用化学放光方法检测人类VEGF
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A浓度的生物分析方法，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。
[0006]根据本专利技术所提供的一种使用化学放光方法检测人类VEGF
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A浓度的生物分析方法，本方法以配体受体结合原理为基础，将包被蛋白，检测物VEGFA，检测抗体先后结合在固体介质上，然后加入显色底物进行检测；其中，其步骤如下：使固体介质固定住和VEGF
‑
A的特异性蛋白，该特异性蛋白即为包被蛋白，然后加入检测样品，特异地将样品中的VEGF
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A也固定在固体介质上，然后使用可以结合VEGF
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A的第二个抗体，即为检测抗体，将第二个抗体也固定在固定介质上，中间伴随着洗涤的过程，洗去非特异吸附的杂质；第二个抗体需要直接或者间接进行了特殊的标记，最后用标记物相适应的底物进行显色检测。
[0007]在一些实施方式中，检测抗体的标记物为HRP。
[0008]在一些实施方式中，具体的操作步骤如下：抗VEGF融合蛋白用1XPBS稀释到2μg/mL，100μL/孔加入96酶标板白板中，4度过夜孵；第二天，弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，加入300μL/孔的封闭液，室温200rpm孵育1小时；VEGFA标准品使用样品分析液进行梯度稀释，稀释起始浓度为500pg/mL，然后两倍梯度稀释10个点，标准曲线的标准品浓度范围为500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.25pg/mL，15.625pg/mL，7.8125pg/mL，3.9063pg/mL，1.9531pg/mL，0.9766pg/mL，0.4883pg/mL，样品分析液作为空白样品；取封闭好的96酶标板，弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，将稀释好的标准品梯度溶液以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，使用方法分析液将生物素化的抗VEGFA抗体稀释到100ng/mL,以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，使用方法分析液将HRP标记的链霉亲和素1：200进行稀释后，以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；提前半小时将化学发光检测试剂A液和B液平衡到室温，临用前进行1：1混合，以100μL/孔加入微孔板中室温500rpm孵育3分钟后，使用多功能酶标仪使用化学发光的检测程序进行读数。
[0009]在一些实施方式中，所述洗涤液成分为1
×
PBS+0.1％Tween 20，所述封闭液/方法分析液成分为1
×
PBS+1％BSA+0.1％Tween 20。
[0010]在一些实施方式中，所述样品分析液成分为方法分析液中加入10％兔血清。
[0011]在一些实施方式中，包括检测试剂盒，所述试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种使用化学放光方法检测人类VEGF
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A浓度的生物分析方法，本方法以配体受体结合原理为基础，将包被蛋白、检测物VEGFA、检测抗体先后结合在固体介质上，然后加入显色底物进行检测；其中，其步骤如下：使固体介质固定住和VEGF
‑
A的特异性蛋白，该特异性蛋白即为包被蛋白，然后加入检测样品，特异地将样品中的VEGF
‑
A也固定在固体介质上，然后使用可以结合VEGF
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A的第二个抗体，即为检测抗体，将第二个抗体也固定在固定介质上，中间伴随着洗涤的过程，洗去非特异吸附的杂质；第二个抗体需要直接或者间接进行了特殊的标记，最后用标记物相适应的底物进行显色检测。2.根据权利要求1所述的一种使用化学放光方法检测人类VEGF
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A浓度的生物分析方法，其中，检测抗体的标记物为HRP。3.根据权利要求1所述的一种使用化学放光方法检测人类VEGF
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A浓度的生物分析方法，其中，具体的操作步骤如下：抗VEGF融合蛋白用1XPBS稀释到2μg/mL，100μL/孔加入96酶标板白板中，4度过夜孵；第二天，弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，加入300μL/孔的封闭液，室温200rpm孵育1小时；VEGFA标准品使用样品分析液进行梯度稀释，稀释起始浓度为500pg/mL，然后两倍梯度稀释10个点，标准曲线的标准品浓度范围为500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.25pg/mL，15.625pg/mL，7.8125pg/mL，3.9063pg/mL，1.9531pg/mL，0.9766pg/mL，0.4883pg/mL，样品分析液作为空白样品；取封闭好的96酶标板，弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，将稀释好的标准品梯度溶液以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，使用方法分析液将生物素化的抗V...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄启宽，朱国振，余跃云，胡国清，刘野，杨雨生，
申请(专利权)人：上海精翰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：