一种检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒，该检测试剂盒为双抗体夹心法ELISA试剂盒，可用于定量检测人血清或组织匀浆样本中的SNX17，具有操作简单、特异性强、重复性好、敏感度高等优点。本发明专利技术还公开了上述试剂盒的制备方法，该方法制备得到的定量检测SNX17的ELISA试剂盒不仅有助于开展SNX17参与的相关疾病致病机制研究，且检测到的SNX17还具有作为疾病生物标志物的潜在功能，可为后续辅助患者的精准诊疗提供指导。可为后续辅助患者的精准诊疗提供指导。可为后续辅助患者的精准诊疗提供指导。

【技术实现步骤摘要】
一种检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒及其制备方法。

技术介绍

[0002]分拣微管连接蛋白17(sorting nexin 17，SNX17)是分拣微管连接蛋白家族最具代表性成员，人源基因定位在2号染色体(2p23
‑
p2)，分子量为52.9Kda，肽链长度为470aa，分布于所有组织和多种不同类型的细胞，是存在于初级内体的一种衔接蛋白，负责调控多种细胞膜蛋白的转运和蛋白分选等重要细胞生物学过程。
[0003]SNX17具有两个保守结构域：Phox同源结构域(Phox
‑
homology domain,PX domain)和FERM(4.1R/Ezrin/Radixin/Moesin
‑
like domain)结构域。PX结构域大多由3个β折叠伴随3个α螺旋构成，在它们第一和第二个螺旋之间富含脯氨酸的环状结构域，能够直接结合磷酸肌醇的磷酸。PX结构域主要的结合靶点为磷脂酰肌醇
‑3‑
磷酸(Ptdlns3P，PI3P)，通过与PI3P的相互结合，将SNX17募集定位于早期内体膜上，进而引导调节不同的细胞过程，包括胞吞作用、内体分选和货物运输。FERM结构域由4.1R蛋白、埃兹蛋白(ezrin)、根蛋白(radixin)与膜突蛋白(moesin)4个成员组成，与多种膜蛋白中的
“‑
NpxY
‑”/>基序具有高亲和力，因此SNX17通过FERM结构域与
‑
NpxY
‑
基序的相互作用进而绑定蛋白质，参与膜蛋白的转运和蛋白质的分选。同时FERM结构域还是SNX17与P选择素的羧基端相互作用的关键部位，可以调节众多膜相关因子及下游信号分子，参与细胞形态构建及信号转导。
[0004]SNX17通过两个保守结构域从而与多种疾病的发生和发展相关联。T细胞活化的关键成分是受体向细胞表面的内体再循环，从而允许信号和抗原识别的持续整合。而SNX17通过其FERM结构域与TCR和LFA
‑
1相互作用从而防止TCR和LFA
‑
1在溶酶体中的积累和降解，进而促进TCR和LFA
‑
1的循环利用，并最终影响T细胞的活化以及抗原刺激后细胞间的相互作用，从而使免疫突触处的T细胞活化达到最佳状态。
[0005]SNX17作为胞内蛋白广泛存在于肌细胞中，在心肌梗死中通过抑制SERCA2a蛋白的溶酶体降解途径从而保留功能性SERCA2a蛋白来产生抗心律失常作用，提示SNX17在心肌梗死中可作为一种内源性抗心律不齐因子。SNX17还与Jag1a和KRIT1蛋白相互作用促进其再循环。而Jag1a蛋白是Notch信号通路成员，此信号通路涉及斑马鱼神经发生和胰腺发育。而SNX17和KRIT1之间的联系，和脑内发生的海绵状血管瘤的畸形密切相关。此外，SNX17还可能参与重症肌无力的发病机制。研究表明SNX17的FERM结构域能识别低密度脂蛋白受体家族如LRP1的蛋白胞内区域，促进相关受体蛋白的高效重复利用。并有研究也证明了SNX17与LRP4存在相互作用关系，而LRP4抗体是诱导重症肌无力发生的关键抗体之一。
[0006]因此，SNX17作为多种疾病研究中的相关因子，通过定量检测组织匀浆或血清样本中SNX17的含量不仅有助于相关疾病致病机制的研究而且还具有作为疾病生物标志物的潜在功能。目前尚无文献报道针对组织匀浆或血清样本中SNX17的含量提供一种准确、简便、
灵敏度高的检测手段。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种检测人分拣微管连接蛋白17(SNX17)的试剂盒，该试剂盒可定量检测人血清或组织匀浆中的SNX17，不仅有助于开展SNX17参与的相关疾病致病机制研究，而且其检测到的SNX17还具有作为疾病生物标志物的潜在功能，可为后续辅助患者的精准诊疗提供指导。
[0008]本专利技术的目的之二在于提供检测人分拣微管连接蛋白17的试剂盒的制备方法。
[0009]本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：
[0010]一种检测人分拣微管连接蛋白17(SNX17)的ELISA试剂盒，所述试剂盒中包括已包被抗体的酶标板、酶标抗体，所述包被抗体为鼠源抗分拣微管连接蛋白17单克隆抗体，酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体。
[0011]进一步地，所述包被抗体的浓度为2μg/mL，酶标抗体的稀释比例为1:400。
[0012]进一步地，所述试剂盒中还包括人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品、样品稀释液、洗涤液、TMB显色液、反应终止液。
[0013]进一步地，所述样品稀释液为1
×
磷酸盐缓冲液，洗涤液为0.05％PBST溶液，反应终止液为2M H2SO4。
[0014]进一步地，所述试剂盒的检测对象为人血清或组织匀浆。
[0015]本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：
[0016]检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0017](1)人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品的制备：将人分拣微管连接蛋白17质粒转化入表达菌，向表达菌中加入诱导剂诱导人分拣微管连接蛋白17表达，然后从诱导表达的菌液中提取表达得到的人分拣微管连接蛋白17、纯化、透析、冷冻干燥得到人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品；优选地，诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
[0018](2)抗体的包被过程为：将鼠源抗分拣微管连接蛋白17单克隆抗体包被酶标板，孵育、封闭，即得已包被抗体的酶标板；
[0019](3)酶标抗体的制备：采用改良NaIO4标记法制备辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体；
[0020](4)组装试剂盒：将步骤(2)的已包被抗体的酶标板、步骤(3)的酶标抗体与步骤(1)得到的人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品、样品稀释液、洗涤液、TMB显色液、反应终止液组装成ELISA试剂盒。
[0021]进一步地，所述步骤(1)人分拣微管连接蛋白17质粒由以下过程得到：将菌液中带有His标签载体为PET
‑
28A的人分拣微管连接蛋白17原核表达质粒进行质粒扩增、提取，即得人分拣微管连接蛋白17质粒。
[0022]进一步地，步骤(3)改良NaIO4标记法制备辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体的过程为：
[0023]a.将辣根过氧化物酶溶于双蒸水中，向其中加入NaIO4溶液，室温搅拌得到棕绿色溶液1；
[0024]b.向步骤a得到的溶液1中加入乙二醇放置后得到蓝色溶液2，置于醋酸钠缓冲液
中透析过夜；
[0025]c.向透析后的溶液2中加入Na2CO3缓冲液调节溶液pH为9...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括已包被抗体的酶标板、酶标抗体，所述包被抗体为鼠源抗分拣微管连接蛋白17单克隆抗体，酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体。2.如权利要求1所述的检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被抗体的浓度为2μg/mL，酶标抗体的稀释比例为1:400。3.如权利要求1所述的检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品、样品稀释液、洗涤液、TMB显色液、反应终止液。4.如权利要求3所述的检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为1
×
磷酸盐缓冲液，洗涤液为0.05％PBST溶液，反应终止液为2M H2SO4。5.如权利要求1所述的检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测对象为人血清或组织匀浆。6.如权利要求1至5任一项所述的检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品的制备：将人分拣微管连接蛋白17质粒转化入表达菌，向表达菌中加入诱导剂诱导人分拣微管连接蛋白17表达，然后从诱导表达的菌液中提取表达得到的人分拣微管连接蛋白17、纯化、透析、冷冻干燥得到人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品；(2)抗体的包被过程：将鼠源抗分拣微管连接蛋白17单克隆抗体包被酶标板，孵育、封闭，即得已包被抗体的酶标板；(3)酶标抗体的制备：采用改良NaIO4标记法制备辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体；(4)组装试剂盒：将步骤(2)的已包被抗体的酶标板、步骤(3)的酶标抗体与步骤(1)得到的人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品、样品稀释液、洗涤液、TMB显色液、反应终止液组装成ELISA试剂盒。7.如权利要求6所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：高峰，贺笑笑，周淑贤，纪莹，杨浩楠，崔维珂，刘培培，李文博，张琳媛，张婧，赵雪，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：