高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株及其构建方法技术

本发明专利技术涉及助孕技术附属装置的技术领域，特别是涉及一种高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株及其构建方法，纯度高、成本低、生物活性稳定；包括CHO

【技术实现步骤摘要】
高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株及其构建方法


[0001]本专利技术涉及助孕技术附属装置的
，特别是涉及一种高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株及其构建方法。

技术介绍

[0002]WHO统计显示，全球约有4500万~5200万名的夫妇受不孕不育影响，我国育龄夫妇中不孕不育率高达10%，累及人口达1000多万，其中因为排卵障碍而导致的不孕不育约占1/3，不孕不育已成为严重的社会问题，人促卵泡激素在治疗排卵障碍性疾病、体外受精和胚胎移植助孕技术有重要意义。
[0003]FSH是一种由脑垂体前叶嗜碱性细胞分泌的糖蛋白类促性腺激素，是调控哺乳动物生长、性成熟和繁殖的核心激素，与促黄体生成素、促甲状腺激素、绒毛膜促性腺激素共同组成糖蛋白激素家族，具有促进和维持正常性腺发育和生殖的功能。该家族是目前己知的结构最为复杂的蛋白质激素，它们虽然功能不同，结构却极为相似，均可由解离的α亚基和β亚基以非共价键结合形成异二聚体。在同一物种，4种激素的α亚基完全相同，由同一基因编码，而β亚基则是特异的，决定着激素的特定生理功能。一般认为α亚基负责信号转导作用，而β亚基是功能亚基，参与受体结合，后来发现α亚基和β亚基均参与受体结合及信号转导作用。
[0004]目前FSH制剂根据其来源及制备工艺主要分为三大类。第一类是从下丘脑垂体中得到的，简称垂体FSH，因其含量较低，纯度不高，杂质含量高，副作用较大，而逐渐被淘汰。第二类是从绝经后妇女的尿中提取出来的尿源FSH，但存在生物资源有限，个体及批间差异大，尿液中残留的蛋白成分导致FSH的生物学活性降低，且生产成本较高的问题。另一类是重组的人促卵泡素，根据其来源分为大肠杆菌原核表达的FSH,但因其不具有糖基化修饰功能，不能产生有活性的FSH，而且表达产物往往以包涵体的形式存在，二硫键不能正确折叠，无法形成完全正确的空间构象。酵母细胞表达的FSH，但由于巴氏毕赤酵母糖基化模式与哺乳动物细胞的差异，表达产物虽然具有类似的结合能力，但体外活性仅为天然产物活性的1/3。有学者尝试利用昆虫细胞及植物细胞表达FSH，但均存在与天然FSH糖基化差异较大，活性不高及产业化困难的问题。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种纯度高、成本低、生物活性稳定的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株及其构建方法。
[0006]本专利技术的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，包括CHO
‑
S细胞株、pCHO1.0载体、高表达元件和目的蛋白氨基酸序列。
[0007]本专利技术的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，FSHα亚基氨基酸序列为（92aa）：APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS。
[0008]本专利技术的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，FSHβ亚基氨基酸序列为（111aa）：NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE本专利技术的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，pCHO1.0载体采用CMV启动子与人延伸因子EF
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1/2启动子的杂合启动子。
[0009]本专利技术的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株的构建方法，包括以下方案：（1）基于重组质粒pCHO1.0
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Fα和pCHO1.0
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Fβ共转染CHO细胞构建方案。
[0010]（2）基于双表达重组质粒pCHO1.0
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Fα
‑
Fβ转染CHO细胞构建方案。
[0011]与现有技术相比本专利技术的有益效果为：本专利技术采用具有明确产权背景的CHO
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S悬浮细胞株与pCHO1.0高表达载体组合，采用无血清CD培养基及大规模悬浮细胞培养工艺，筛选获得稳定、高表达工程细胞株。通过高表达元件、杂合启动子、信号肽、KOZAK序列的合理设计构建并筛选稳定、高表达的工程细胞株。建立的CHO
‑
S工程细胞系支持高密度、无血清悬浮培养工艺，该工程细胞株筛选全程均采用无血清、无动物源成分的化学成分界定（CD）培养基，为后期工艺开发奠定基础。建立了高通量无血清培养基筛选平台，提高目标蛋白的表达量及蛋白质量，建立稳定高产的无血清细胞罐悬浮培养工艺。优选的工程细胞株经培养后，表达量不低于200mg/L，收集培养上清经纯化后采用SDS
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PAGE、Western blot及N端氨基酸测序对目的产物进行初步确证，经大鼠卵巢增重法(Steelman
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Pohley法)测定目的产物比活最高可达16036 IU/mg，达到国内外先进水平，该重组CHO细胞株支持从构建、筛选到培养全程无血清CD培养基工艺，全程无血清及蛋白成分，无动物来源成分，支持悬浮培养和生物反应器生产，更易于规模放大，方便产业化。
附图说明
[0012]图1是共转染重组质粒pCHO1.0
‑
Fα和pCHO1.0
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Fβ构建示意图；图2是双表达重组质粒pCHO1.0
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Fα
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Fβ的构建示意图；图3是目的蛋白SDS
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PAGE及Western blot分析的示意图；图4是目的蛋白HPLC纯度分析示意图；图5是量反应平行线法检测目的蛋白比活性示意图。
具体实施方式
[0013]下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0014]实施例：一、人工合成hFSH α亚基及β亚基基因，克隆至pMD
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18T载体，经酶切连接亚克隆至pCHO1.0载体，构建重组共转染质粒pCHO1.0
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Fα、pCHO1.0
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Fβ及重组双表达质粒pCHO1.0
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Fα
‑
Fβ，见图1，图2。转染CHO
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S悬浮细胞，通过嘌呤霉素及MTX加压筛选，经FSH检测试剂盒测定表达量。通过多轮有限稀释法获得高表达重组阳性单克隆细胞株，并对细胞株进行产量评估，优选表达量高、活性好、表达稳定的细胞株作为工程细胞株。细胞株构建、筛选过程如下：（1） 重组表达质粒的构建
①
共转染重组质粒pCHO1.0
‑
Fα和pCHO1.0
‑
Fβ的构建方案
②
双表达重组质粒pCHO1.0
‑
Fα
‑
Fβ的构建方案（2）CHO
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S细胞的转染及筛选：分别提取上述已成功构建共转染重组质粒pCHO1.0
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，其特征在于，包括CHO
‑
S细胞株、pCHO1.0载体、高表达元件和目的蛋白氨基酸序列。2.如权利要求1所述的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，其特征在于，FSHα亚基氨基酸序列为（92aa）：APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS。3.如权利要求2所述的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，其特征在于，FSHβ亚基氨基酸序列为（111aa）：NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVP...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹玉锋，常东英，张健锋，李霄培，韩顺子，李铮，唐剑光，时成波，
申请(专利权)人：长春生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：