一种获得人类基底板FloorPlate细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种体外获得人类基底板Floor Plate(FP)细胞的方法，是通过基因修饰人胚胎干细胞系H9，在人19号染色体插入NKX2.2

【技术实现步骤摘要】
virus，AAV)能通过同源重组修复DNA损伤的特点，对人细胞系进行定点基因修饰；TRE3G利用Tet
‑
on系统可诱导性调控是否过表达载体上CMV启动子后面构建的基因，外源性添加Doxycycline(DOX)促进人rTetR与TRE结合，从而促进下游基因NKX2.2表达，无DOX状态下游基因不表达，供体载体上还存在与人19号染色体特定位点同源的同源臂
[9，10]，能够精确插入NKX2.2
‑
CDS进入1号外显子与2号外显子中间。
[0007]现已报道的利用人胚胎干细胞分化人类基底板细胞的各种方法中的不足主要有：经典分化手段需要在分化第一天添加高浓度的蛋白SHH，蛋白SHH存在价格昂贵且因生产批次与保存手段导致的浓度不稳定的缺点，这会导致分化得到FP效率的不稳定。同样利用基因编辑过表达转录因子或是利用化合物调控抑制GSK3β和Activin/Nodal信号通路的分化手段都需要更长的分化周期以得到功能性人类基底板细胞。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种体外诱导基因修饰过的人胚胎干细胞分化获得功能性人类基底板Floor Plate细胞的方法。
[0009]本专利技术的另一个目的是提供上述方法中使用的载体系统及其应用。
[0010]为了实现本专利技术目的，本专利技术利用稳转过表达的人胚胎干细胞体系，诱导分化12天就能够得到功能性分泌SHH的人类基底板细胞，分化稳定性和效率都得到了提高。本专利技术体外诱导人胚胎干细胞分化获得功能性人类基底板Floor Plate细胞的方法是通过在体外诱导人胚胎干细胞向神经前体细胞分化，并于细胞分化前期诱导人胚胎干细胞低水平过表达转录因子，使其定向分化为人类基底板细胞。
[0011]前述方法中，所述人胚胎干细胞为通过在其19号染色体插入NKX2.2
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CDS区域和可诱导Tet
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on表达系统的H9细胞系H9
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iOE
‑
NKX2.2，能够通过外源性Doxycycline(DOX，MCE，强力霉素)剂量控制NKX2.2的表达水平的人胚胎干细胞系。
[0012]本专利技术中，NKX2.2
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CDS是指人NKX2.2的编码区序列，例如使用NCBI登录号为NP_002500.1的NKX2.2的CDS(coding sequence，编码区序列)。
[0013]本专利技术的一个优选实施例中，Tet
‑
on表达系统可以通过使用质粒AAVS1
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TRE3G
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EGFP(例如，源自Addgene plasmid#52343；http://n2t.net/addgene:52343；RRID:Addgene_52343)获得。
[0014]本专利技术中，H9细胞可以采用实验室保存或者市售的该细胞株。在本专利技术的一个优选实施例中，使用的H9细胞源自WiCell。
[0015]本专利技术提供了一套载体系统，包括含有NKX2.2
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CDS、可诱导Tet
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on表达系统。在本专利技术的一个优选例中，使用了包括AAVS1
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TRE3G
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NKX2.2和px459
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AAVS1
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gRNA的载体系统。
[0016]前述方法中，在人胚胎干细胞的19号染色体插入NKX2.2
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CDS区域和可诱导Tet
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on表达系统，是指电转诱导过表达载体AAVS1
‑
TRE3G
‑
NKX2.2进入人胚胎干细胞系H9中。
[0017]前述方法中，诱导向神经前体细胞分化是使用N2B27培养基培养10
‑
14天。较好的，诱导向神经前体细胞分化的时间不超过13天，更好的，不超过12天。
[0018]前述方法中，于细胞分化前期，即N2B27培养基培养的前5
‑
7天培养基中添加DOX。较好的，细胞分化前期不超过7天，更好的，细胞分化前期为6天。
[0019]本专利技术的实验结果表明，在FOXA2
+
第二天比例最高的组别，即0.01μg/mL条件下，
若继续过表达NKX2.2，过表达持续到第十二天FOXA2
+
细胞比例会下降至6.12
±
3.20％(图3)，持续过表达抑制了人胚胎干细胞向FP分化的进程，转录因子NKX2.2对于FP的诱导作用需要更精确的调控，通过设置不同的低剂量DOX诱导时间，并收集第十二天细胞的RNA样本，通过QPCR数据能够初步阐释转录因子NKX2.2的表达时间对于FOXA2的表达具有影响，第四、七天FOXA2的转录水平正相关于NKX2.2的转录水平，而第七天后负相关于NKX2.2转录水平(图3)。
[0020]为了阐释清楚具体过表达时间持续几天能够得到功能性FP细胞，进一步进行试验将DOX浓度设置为最适浓度0.01μg/mL，设置第二、四、七、九天撤去DOX，每个组别均培养至第十二天，通过收集第十二天细胞的条件培养基，通过条件培养基培养神经前体细胞，免疫荧光鉴定背腹侧分区中的腹侧标志物包括NKX2.2、NKX6.1、EN1的表达水平，鉴定是否分化得到功能性FP，即鉴定分泌腹侧化因子SHH的相对高低，结果显示所有组别只表达NKX6.1，不表达NKX2.2和EN1，这说明条件培养基培养得到的细胞是腹侧vP2和PMN这两个区域的细胞(图4)，根据NKX6.1表达情况可见，第七天撤去DOX后能够得到较高浓度的SHH，具有最强的腹侧化能力，神经前体细胞的NKX6.1表达水平最高。
[0021]前述方法中，诱导人胚胎干细胞低水平过表达转录因子，即在培养基中添加强力霉素(Doxycycline，DOX)，添加终浓度为0.008
‑
0.03μg/mL，诱导转录因子NKX2.2低水平表达。例如，加入DOX的终浓度为0.01、0.02、0.023、0.025、0.028μg/mL。
[0022]高浓度DOX(0.05、0.2μg/mL)组别几乎不表达FOXA2，同时几乎不表达OTX2，且0.2μg/mL组别在过表达第二天表型上过于扁平，形态既不具有神经干细胞特征也不是FP形态(图2)，这说明高浓度过表达组别细胞似乎脱离了神经外胚层体系。
[0023]前述方法中，分化得到的人类人类基底板细胞为功能性能够分泌SHH蛋白的人类基底板细胞。在本专利技术的一个优选实施例中，所述的SHH为UniProtKB数据库编号为Q15465的蛋白。
[0024]具体地，本专利技术提供了一套技术方案：
[0025](1)单层贴壁培养实质未分化的人胚胎干细胞。
[0026](2)电穿孔转染质粒进入人胚胎干细胞得到基因编辑的人胚胎干细胞系。
[0027](3)在分化第一阶段前6天培养基中加入诱导插入基因表达的DOX。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外获得人类基底板细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括：在体外培养的人胚胎干细胞中，在其19号染色体插入NKX2.2
‑
CDS区域和诱导Tet
‑
on表达系统,促进人胚胎干细胞向神经前体细胞分化；在人胚胎干细胞向神经前体细胞分化前期，诱导人胚胎干细胞低水平过表达转录因子；使人胚胎干细胞定向分化为人类基底板细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在人胚胎干细胞的19号染色体插入NKX2.2
‑
CDS区域和可诱导Tet
‑
on表达系统，是指电转诱导过表达载体AAVS1
‑
TRE3G
‑
NKX2.2进入人胚胎干细胞系中。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，促进人胚胎干细胞向神经前体细胞分化是使用N2B27培养基培养10
‑
14天。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞分化前期是N2B27培养基培养的前5
‑
7天。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，诱导人胚胎干细胞低水平过表达转录因子，即在培养基中添加强力霉素，添加终浓度为0.008
‑
0.03μg/mL。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分化得到的人类基底板细胞为功能性能够分泌SHH蛋白的人类基底板细胞。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞为通过在其19号染色体插入NKX2.2
‑
CDS区域和可诱导Tet
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on表达系统的H9细胞系。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：(1)单层贴壁培养实质未分化的人胚胎干细胞；(2)电穿孔转染插入NKX2.2
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CDS区域和可诱导Tet
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on表达系统的质粒进入人胚胎干细胞得到基因编辑的人胚胎干细胞系；(3)在分化第一阶段前5
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7天培养基中加入诱导插入基因表达的DOX；(4)在分化第二阶段培养基中不添加DOX；整个分化过程的时间为10
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14天。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分化过程每日更换一次培养基，分化后期随细胞量的增加每日增加使用的培养基量。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，人胚胎干细胞的培养基为E8培养基。11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的质粒包括px459
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AAVS1
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gRNA和AAVS1
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TRE3G
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NKX2.2。12.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆建峰，芦心雨，曹立宁，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：