人类血清素神经元TPH2报告基因细胞系的构建方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种稳定的TPH2报告基因人多能干细胞系的构建方法与应用。本发明专利技术还包括一种表达血清素神经元TPH2报告基因的载体系统，所述的载体系统包括但不限于：靶向人类血清素神经元TPH2基因终止密码子附近的单链向导RNA的向导载体，和携带人类血清素神经元TPH2基因终止密码子附近同源臂的供体载体。本发明专利技术还包括转入上述载体系统的TPH2报告基因人多能干细胞系的构建方法，本发明专利技术可应用于鉴定干细胞分化来源的人类血清素神经元，以及在活细胞状态下对血清素神经元的形态和功能进行研究。元的形态和功能进行研究。元的形态和功能进行研究。

【技术实现步骤摘要】
人类血清素神经元TPH2报告基因细胞系的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种血清素神经元TPH2报告基因人多能干细胞系的构建方法与应用。

技术介绍

[0002]在中枢神经系统中，TPH2基因在血清素(五羟色胺)神经元中特异表达，其编码的色氨酸羟化酶二是血清素合成的关键限速酶，在血清素的合成过程中负责催化色氨酸转变成五羟色氨酸，最后通过氨基酸脱羧反应生成五羟色胺。
[0003]脑内血清素神经元具有调控情绪和呼吸等功能，与重度抑郁症以及婴儿猝死综合等疾病息息相关，然而血清素神经元调控情绪以及呼吸的具体机制目前尚不明确。虽然体外诱导人多能干细胞可以分化得到血清素神经元，但是最终分化体系中非血清素神经元仍然占据较高比例，活细胞状态下研究血清素神经元的形态和功能也面临巨大挑战。
[0004]因此，建立荧光标记的血清素神经元的报告细胞系将有利于人类血清素神经元的相关研究，为重度抑郁症等疾病的药物筛选提供广阔的应用平台。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在建立TPH2基因的报告细胞系，来指针分化体系中的人类血清素神经元，解决分化体系中多种细胞混合条件下对血清素神经元进行研究的难题。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种表达血清素神经元TPH2报告基因的载体系统，所述的载体系统包括但不限于：
[0007]靶向人类血清素神经元TPH2基因终止密码子附近的单链向导RNA的向导载体，和
[0008]携带人类血清素神经元TPH2基因终止密码子附近同源臂的供体载体。
[0009]本专利技术中，单链向导RNA(sgRNA)覆盖了TPH2基因终止密码子，报告基因插入后可破坏原始单链向导RNA识别序列，从而防止被Cas9蛋白二次切割。
[0010]TPH2基因终止密码子附近的单链向导RNA是指TPH2基因终止密码子上下游100bp以内TPH2基因终止密码子附近同源臂是指距离终止密码子上下游各1500bp左右。
[0011]在本专利技术的一个实施例中，TPH2基因终止密码子附近同源臂如SEQ ID NO 21或者SEQ ID NO 22所示。
[0012]较好的，靶向人类血清素神经元TPH2基因终止密码子附近的单链向导RNA的向导载体选自：PX330
‑
sgT、PX458
‑
sgT或者PX459
‑
sgT。
[0013]在本专利技术的一个实施例中，PX330
‑
sgT的序列如SEQ ID NO 19所示。
[0014]另一方面，本专利技术提供了一种稳定的血清素神经元TPH2报告基因人多能干细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0015](1)构建携带靶向TPH2基因终止密码子附近的单链向导RNA的向导载体PX330
‑
sgT；
[0016]获得靶向人类TPH2基因终止密码子附近的sgRNA，合成两条寡聚核苷酸链，退火并
磷酸化后插入到PX330的BbSI位点，重组载体转化大肠杆菌，挑取单克隆菌进行测序验证重组成功的质粒PX330
‑
sgT；
[0017](2)构建报告基因供体载体的工具载体pUC19
‑
T2A
‑
EGFP
‑
CMV
‑
PuroR；
[0018]从AAVS1
‑
TRE3G
‑
EGFP中扩增出puromycin(嘌呤霉素)的抗性基因，克隆到FLAG
‑
HA
‑
pcDNA3.1
‑
表达载体的CMV启动子后，得到pcDNA3.1
‑
CMV
‑
PuroR
‑
polyA载体，从此载体中扩增CMV
‑
PuroR
‑
polyA序列，同时从PX458中扩增T2A
‑
EGFP，将扩增的两个片段重组到pUC19载体的多克隆位点，得到工具载体pUC19
‑
T2A
‑
EGFP
‑
CMV
‑
PuroR；
[0019](3)构建TPH2报告基因的供体载体TPH2
‑
T2A
‑
EGFP；
[0020]从人的基因组中扩增TPH2终止密码子前后1.5kb的左右同源臂，THL和THR，在工具载体的左右两侧的多克隆位点分别插入THL和THR，得到TPH2报告基因供体载体TPH2
‑
T2A
‑
EGFP；
[0021](4)TPH2报告基因人多能干细胞系的构建；
[0022]将向导载体PX330
‑
sgT和供体载体TPH2
‑
T2A
‑
EGFP电转到人多能干细胞H9，经puromycin筛选，获得抗性克隆后，提取细胞基因组进行PCR扩增鉴定插入片段，并测序，最终获得稳定的EGFP标记的报告血清素神经元TPH2基因的人多能干细胞系。
[0023]较好的，所述步骤1)中构建向导载体的工具载体包括但不限于：PX330、PX458或者PX459中的一种或者几种。
[0024]较好的，所述步骤2)中用于构建打靶载体工具载体的报告基因元件包括但不限于tdTomato,YFP,RFP或者EGFP中的一种或者几种。
[0025]较好的，所述步骤2)中用于构建打靶载体工具载体的抗性筛选元件包括但不限于PuroR,NeoR。
[0026]较好的，所述步骤3)是从工具载体pUC19
‑
T2A
‑
EGFP
‑
CMV
‑
PuroR出发，插入TPH2基因的左右同源臂。
[0027]较好的，所述步骤4)中电转的人多能干细胞系包括但不限于人胚胎干细胞系或者诱导多能干细胞系(例如H1,RUES1,RUES2以及人体细胞重编程来源的多能干细胞)。
[0028]在本专利技术的优选实施例中，人类血清素神经元TPH2报告基因稳定细胞系的构建方法如下：
[0029]1.1构建携带靶向TPH2基因终止密码子附近的单一向导RNA(single guide RNA)的向导载体(例如，PX459
‑
sgT或者PX330
‑
sgT)；
[0030]1.2构建携带TPH2基因终止密码子附近同源臂的供体载体(TPH2
‑
T2A
‑
EGFP)；
[0031]1.3将PX459
‑
sgT和TPH2
‑
T2A
‑
EGFP载体电转到人多能干细胞系中，经puromycin抗性筛选得到稳定的EGFP标记TPH2基因的人多能干细胞系。
[0032]上述人类血清素神经本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达血清素神经元TPH2报告基因的载体系统，其特征在于：所述的载体系统包括但不限于：靶向人类血清素神经元TPH2基因终止密码子附近的单链向导RNA的向导载体，和携带人类血清素神经元TPH2基因终止密码子附近同源臂的供体载体。2.如权利要求1所述的载体系统，其特征在于：靶向人类血清素神经元TPH2基因终止密码子附近的单链向导RNA的向导载体选自：PX330
‑
sgT、PX458
‑
sgT或者PX459
‑
sgT。3.一种稳定的血清素神经元TPH2报告基因人多能干细胞系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)构建携带靶向TPH2基因终止密码子附近的单链向导RNA的向导载体PX330
‑
sgT；获得靶向人类TPH2基因终止密码子附近的sgRNA，合成两条寡聚核苷酸链，退火并磷酸化后插入到PX330的BbSI位点，重组载体转化大肠杆菌，挑取单克隆菌进行测序验证重组成功的质粒PX330
‑
sgT；(2)构建报告基因供体载体的工具载体pUC19
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T2A
‑
EGFP
‑
CMV
‑
PuroR；从AAVS1
‑
TRE3G
‑
EGFP中扩增出puromycin的抗性基因，克隆到FLAG
‑
HA
‑
pcDNA3.1
‑
表达载体的CMV启动子后，得到pcDNA3.1
‑
CMV
‑
PuroR
‑
polyA载体，从此载体中扩增CMV
‑
PuroR
‑
polyA序列，同时从PX458中扩增T2A
‑
EGFP，将扩增的两个片段重组到pUC19载体的多克隆位点，得到工具载体pUC19
‑
T2A
‑
EGFP
‑
CMV
‑
PuroR；(3)构建TPH2报告基因的供体载体TPH2
‑
T2A
‑
EGFP；从人的基因组中扩增TPH2终止密码子前后分别1.5kb的左右同源臂，THL和THR，在工具载体的左右两侧的多克隆位点...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆建峰，许婷，曹立宁，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：