本发明专利技术公开了一种可分泌性表达免疫毒素的嵌合抗原受体(CAR)表达系统，将嵌合抗原受体遗传修饰的免疫细胞(CAR-免疫细胞)和免疫毒素相结合，构建了一种能够分泌性表达免疫毒素的新型CAR-免疫细胞，用于肿瘤的免疫治疗。本发明专利技术的技术方案中的CAR和免疫毒素识别肿瘤细胞上两种不同的抗原或者同一个肿瘤抗原的两个不同的抗原表位。CAR基因和免疫毒素基因在免疫细胞中的表达可以是组成性地(持续性地)表达，也可以被表达调控元件调控(例如通过SynNotch开关，当所述CAR-免疫细胞识别并结合其中一种肿瘤抗原(或抗原表位)后，激活靶向另一种肿瘤抗原(或抗原表位)的CAR和免疫毒素的表达)。表达)。
【技术实现步骤摘要】
可分泌性表达免疫毒素的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞
[0001]本专利技术属于生物
具体涉及一种新型的可分泌表达免疫毒素的嵌合抗原受体表达系统以及该系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
[0002]二十世纪以来人类的生活环境污染日趋加剧、生活环境不断恶化，人们与致癌因素密切接触，使得恶性肿瘤的专利技术率逐年递增，恶性肿瘤已经成为人类健康的头号敌人。据2018年全球癌症数据分析全球癌症新发病病例为1810万人，癌症死亡病例为960万人。肿瘤免疫很早就被提出，同时也是成为继肿瘤传统治疗方法(化学治疗、手术治疗及放射治疗)之后的第四种肿瘤疗法，其可激活特异性，重要的免疫细胞，直接靶向攻击肿瘤细胞，具有较高的疗效和安全性，是目前全球肿瘤治疗研究的热点。
[0003]肿瘤免疫治疗是激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。主要包括免疫细胞治疗(主要是CAR-T细胞和CAR-NK细胞)、抗体治疗和溶瘤病毒。免疫细胞包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，主要包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、K淋巴细胞、NK淋巴细胞，T淋巴细胞在外周血占淋巴细胞总数的65％-75％，而且有很多T细胞亚群。免疫细胞治疗有CIK(cytokine induced killer cell)，将患者自身免疫细胞(主要是T细胞和NK细胞)进行分离，体外活化培养，然后再回输给患者，整个过程称为细胞过继治疗。抗体治疗又可细分为裸抗(抑制肿瘤的生长信号，抗血管生成)、抗体-毒素偶联物、免疫检查点抑制剂、双特异性抗体，抗体-细胞毒性蛋白融合(如pseudomonas exotoxin PE,ricin toxin,RNase等)、抗体-细胞因子融合蛋白(IL-2,IL-12,IFN等)。
[0004]从肿瘤免疫治疗活性上看，CAR-T、T细胞介导的双特异抗体和抗体-毒素偶联物要普遍强于其它治疗手段，是目前研究最多、最有希望的肿瘤免疫治疗手段。但是这三种免疫治疗手段都面临着各自的问题，除了需要进一步挖掘活性提升机制和解决抗药性外，剂量限制性毒副作用(dose-limited toxicities)严重制约了其治疗潜力的发挥。CAR-T细胞在制备的过程中就已经将T细胞进行了激活，因此在给药后即使未进入肿瘤部位也会产生大量的细胞因子(细胞因子风暴)，严重限制了CAR-T的临床治疗。双特异抗体和免疫毒素在理论上不存在预激活T细胞(pre-activated T cell)的情况,但是单抗原靶向性的双特异抗体和免疫毒素仍然存在“在靶脱瘤”(on-target off-tumor)的风险,因为几乎所有的肿瘤抗原都在其它正常组织有低水平的表达。目前只有针对血液肿瘤B淋巴瘤表面抗原CD19的CAR-T治疗在临床上取得了可喜的成绩，但是随着大量临床实验的进行发现靶向CD19的CAR-T并不是所向披靡，部分患者仍旧对其没有反应，还产生了耐受作用，归其原因发现肿瘤表面CD19的抗原丢失，表达量下调。此外除了血液肿瘤，免疫治疗在实体瘤治疗不尽如意，主要是实体瘤肿瘤微环境、存在大量负调控蛋白，加上免疫治疗在实体瘤治疗中伴随大量炎症因子释放等，使得免疫治疗在实体瘤中的治疗效果很差，远远低于血液肿瘤的免疫治疗。
[0005]免疫毒素(immunotoxin)是一类将识别肿瘤抗原的单克隆抗体与杀死肿瘤细胞的毒素蛋白进行基因重组所构建的融合蛋白，其中的单抗分子一般是采用单链scFv抗体或者单域VH抗体，毒素蛋白多采用铜绿假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A,简称PE，如PE38、PE24,数字代表截短的毒素的分子量)和白喉毒素(Diphtheria toxin,简称DT，如DT390，数字代表N-端390个氨基酸)，其它毒素还有霍乱毒素(cholera toxin,CET40)、炭疽毒素(anthrax toxin)、植物性毒素(如蓖麻毒素(ricin)、相思豆毒蛋白，槲寄生凝集素、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素(gelonin)、丝瓜毒素或皂草素(saporin))。PE、DT和CET40属于同一类型毒素。PE类的免疫毒素作用机制是抗体通过与细胞表面抗原蛋白结合，靶向肿瘤细胞，将免疫毒素蛋白带入到肿瘤细胞内，使肿瘤细胞的翻译延伸因子2(eEF2)进行不可逆地ADP化修饰失活，从而抑制肿瘤细胞的蛋白质合成。免疫毒素活性很强，但是免疫毒素攻击癌症细胞的同时也会产生非特异性毒性问题，也能导致正常细胞的死亡，同时免疫毒素由于分子量较小半衰期较短，需要持续给药，还有毒副作用非常大，常见血管渗透综合征。
[0006]针对以上的面临的问题，如何提高CAR-T的肿瘤杀伤能力是目前研究者们关注的热点。
技术实现思路
[0007]本专利技术针对现有肿瘤免疫治疗技术的不足，结合免疫毒素和嵌合抗原受体的细胞靶向性和肿瘤细胞杀伤力，构建了一种双效的、能分泌免疫毒素的嵌合抗原受体表达系统，利用该系统遗传改造的免疫细胞(CAR-免疫细胞)能同时表达嵌合抗原受体和免疫毒素，具有更强的抗肿瘤活性。本专利技术的技术方案中CAR基因和免疫毒素基因识别肿瘤细胞上两种不同的抗原或者同一个肿瘤抗原的两个不同的抗原表位。CAR基因和免疫毒素基因在免疫细胞中的表达可以是组成性的，也可以被表达调控元件调控，例如，通过SynNotch开关，CAR-免疫细胞靶向肿瘤组织并结合肿瘤细胞表面抗原后，免疫细胞启动嵌合抗原受体和免疫毒素的表达，使免疫毒素在肿瘤部位选择性地富集，避免了免疫毒素系统性给药所带来的副作用，充分发挥免疫毒素和免疫细胞治疗的双重联合杀伤机制。
[0008]本专利技术具体技术方案如下：一种分泌性表达免疫毒素的嵌合抗原受体表达系统，包含嵌合抗原受体表达元件和免疫毒素表达元件，所述嵌合抗原受体和免疫毒素分别识别肿瘤细胞表面相同或不同的抗原或抗原表位。
[0009]本专利技术所述表达系统的核心元件由真核细胞启动子和嵌合抗原受体的编码基因、免疫毒素的编码基因构成。启动子包括但不限于经典的哺乳动物细胞组成性启动子CMV,SV40,EF2。所述嵌合抗原受体和免疫毒素分别识别肿瘤细胞表面不同的抗原或抗原表位或同一个抗原的不同表位。
[0010]本专利技术所述嵌合抗原受体包括但不限于经典的CAR结构，通常包括抗原结合区和功能区(铰链区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区)。也适用于各种升级型CAR结构，如一代、二代、三代CAR。
[0011]优选的，嵌合抗原受体的功能区氨基酸序列如SEQ ID No：1、3、5所示或SEQ ID No：1、3、5的同效突变体(序列SEQ ID No：1、3、5对应的核苷酸序列分别为SEQ ID No：2、4、
6)，所述的同效突变体是指突变体的序列和所述的序列有90％或以上的相似性、但是突变体的功能性质和所述序列相同。
[0012]一个优选示例，本专利技术所述嵌合抗原受体氨基酸序列如SEQ ID No：31所示。
[0013]本专利技术所述的免疫毒素包括抗原识别片段和活性片段，其中活性片段本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种分泌性表达免疫毒素的嵌合抗原受体表达系统，其特征在于包含嵌合抗原受体表达元件和免疫毒素表达元件，所述嵌合抗原受体和免疫毒素分别识别肿瘤细胞表面相同或不同的抗原或抗原表位。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体表达系统，其特征在于所述嵌合抗原受体包括抗原结合区和功能区，所述的免疫毒素包括抗原识别肽段和杀伤肿瘤细胞的活性肽段，嵌合抗原受体的抗原结合区和免疫毒素的抗原识别肽段选自抗体、抗体的抗原结合片段或其任意组合。3.如权利要求2所述的嵌合抗原受体表达系统，其特征在于所述嵌合抗原受体的抗原结合区和免疫毒素的抗原识别片段选自Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、scFv、VH中的一种或几种。4.如权利要求2所述的嵌合抗原受体表达系统，其特征在于所述免疫毒素的活性肽段选自假单胞菌外毒素、白喉毒素、霍乱毒素、炭疽毒素、蓖麻毒素、白树毒素、皂草素中的一种或几种。5.如权利要求1所述的嵌合抗原受体表达系统，其特征在于嵌合抗原受体和免疫毒素的表达方式可以为组成性的表达方式，或者为受表达调控元件调控的条件诱导性的表达方式。6.如权利要求5所述的嵌合抗原受体表达系统，其特征在于所述表达调控元件选自synNotch系统、四环素介导的调控系统、雌激素受体介导的调控系统中的一种或几种。7.如权利要求6所述的嵌合抗原受体表达系统，其特征在于所述synNotch系统的胞外域与嵌合抗原受体和免疫毒素识别肿瘤细胞表面的抗原表位不同。8.如权利要求1所述的嵌合抗原受体表达系统，其特征在于所述肿瘤细胞表面抗原选自Glypican-3、B7-H3、Mesothelin、EGFRvIII中的一种或几种。9.如权利要求6所述的嵌合抗原受体表达系统，其特征在于所述synNotch系统靶向肿瘤细胞表面抗原后，其胞内转录因子激活嵌合抗原受体和免疫毒素的表达，synNotch的抗原识别片段和嵌合抗原受体以及免疫毒素分别识别并靶向肿瘤细胞不同的表面抗原或抗原表位，或者相同肿瘤抗原的不同抗原表位。10.如权利要求9所述的嵌合抗原受体表达系统，其特征在于所述synNotch系统的synNotch蛋白包括胞外抗原识别区和核心控制区，所述synNotch蛋白核心控制区的氨基酸序列如SEQ ID No：29所示或SEQ ID No：29的同效突变体；嵌合抗原受体包...
【专利技术属性】
技术研发人员：丰明乾，陈鑫，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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