改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用技术

本发明专利技术提供了一种改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用，将短的DNA片段插入特定DNA区域，改变靶标DNA序列，此方法可以被应用于基因修复和基因治疗。例如，用于造血干细胞HBB基因修复，利用基因编辑技术靶向修复β

【技术实现步骤摘要】
改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用。

技术介绍

[0002]近年细菌和古细菌中一种用来抵御噬菌体和质粒等外源DNA片段入侵的获得性免疫机制得到了阐释。该系统由Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)和CRISPR
‑
associated(CAS)基因组成。CRISPR系统的免疫干扰过程主要包括3个阶段：适应、表达和干扰。适应阶段，CRISPR系统会将来自噬菌体或质粒的DNA短片段整合到前导序列和第一段重复序列之间，每一次整合都伴随着重复序列的复制，进而形成一个新的重复
‑
间隔序列单元。表达阶段，CRISPR基因座会被转录成一段CRISPR RNA(crRNA)前体(pre
‑
crRNA)，该前体在Cas蛋白和反式编码小RNA(trans
‑
encoded small RNA，tracrRNA)的存在下会在重复序列处被进一步加工成小的crRNA。成熟的crRNA与Cas蛋白形成Cas/crRNA复合体。干扰阶段，crRNA通过其与靶序列互补的区域引导Cas/crRNA复合体寻找靶点，并在靶点位置通过Cas蛋白的核酸酶活性造成靶点位置的双链DNA断裂，从而使靶标DNA失去原有功能。其中与靶点3
′
端紧邻的3个碱基必须是5
′‑
NGG
‑3′
的形式，从而构成Cas/crRNA复合体识别靶点所需的PAM(protospacer adjacent motif)结构。
[0003]CRISPR系统分为I，II，III型三个家族，其中II型系统仅需要Cas9蛋白即可在tracrRNA的协助下将pre
‑
crRNA加工成与tracrRNA结合的成熟crRNA。人们发现通过人工构建模拟crRNA：tracrRNA复合体的单链嵌合体引导RNA(guide RNA，又称sgRNA)，即可有效的介导Cas9蛋白对靶点的识别和切割，从而为在目标物种中利用CRISPR系统对目标DNA进行修饰提供了广阔的前景。
[0004]β
‑
地中海贫血是一种常见的由于β
‑
珠蛋白基因(HBB基因)缺陷导致成人血红蛋白异常的遗传性疾病，我国“地贫”基因携带者约3000万人，涉及近3000万家庭、1亿人口，重型和中间型“地贫”患者约30万人。其中，密码子(Codon)41/42(
‑
TCTT)基因型是我国“地贫”中最为多见的一种，发病机制为HBB基因密码子41/42(
‑
TCTT)移码突变造成氨基酸编码异常并形成终止密码子导致蛋白翻译的提前终止，使得HBB基因的功能丧失。目前，中间型和重型患者需要长期输血和去铁治疗来维持生命，唯一根治方式为异体造血干胞移细植术，但主要实施障碍是我国血液资源的紧缺、异体造血干细胞配型困难及移植相关并发症等。其中，利用慢病毒载体进行基因治疗，表现出极大的潜力，但是半随机的载体整合方式，具致癌风险。同时慢病毒中的表达元件在造血干细胞长期归巢和自我更新的过程中会逐渐沉默，使得疗效下降，极有可能无法达到终身治愈的目的。另外，临床所需的高浓度、高质量的慢病毒对设备和技术的要求极高，成本很难降低。因此，并行的、更加安全、成本更低的临床方案是非常有必要的。
[0005]理想的基因治疗方法，是修复或破坏患者造血干细胞DNA中传统的地贫突变，使之重新恢复基因功能，并在内源转录控制因子的作用下永久产生野生型成体β
‑
珠蛋白，从而
正常分化为红系细胞。DNA序列在基因编辑后的修复方式以非同源性末端接合(Non
‑
homologous end joining，NHEJ)修复为主，同源重组介导的修复(Homology directed repair，HDR)所占的比例较低，而修复缺失突变需要高效的HDR效率。并且，传统的HDR修复用的是很长的双链或者单链DNA模板，两边必须得有比较长的片段作为同源臂，然后通过细胞内源的同源重组(DNA错配修复通路中的一种)把模板DNA交换上去。此外，人体内能够长期归巢并自我更新的长期造血干细胞(long
‑
term hematopoietic stem cell，LT
‑
HSC)是一群处于G0期的细胞，而研究表明G0期细胞中DNA修复很少以HDR的方式进行，主要通过NHEJ方式进行。

技术实现思路

[0006]本专利技术是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种能够不依赖于HDR的、可改变或者修复特定DNA序列的改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用。例如，对HBB基因密码子41/42(
‑
TCTT)缺失导致的氨基酸编码异常进行修复。
[0007]本专利技术利用基因编辑技术对密码子41/42(
‑
TCTT)导致的氨基酸编码异常进行修复。
[0008]本专利技术针对密码子41/42(
‑
TCTT)移码突变导致的氨基酸编码异常进行了深入的研究，发现密码子41/42(
‑
TCTT)的突变使得编码HBB基因的第42个密码子处缺失TCTT从而造成氨基酸编码的紊乱，并在缺失位点后不远处形成终止密码子使得蛋白翻译提前终止，导致基因功能的丧失。
[0009]理论上，CRISPR
‑
Cas系统切割目标DNA位点产生双链断裂，会出现大概率的移码突变，其中在致病位点处indel后碱基数的改变若为3n+4(n为整数)，即有可能修复患者基因型中的氨基酸编码紊乱，本专利技术采用插入双链缺失片段的策略大大增加了DNA修复的概率，可增加基因组区域正常转录产生的β
‑
珠蛋白mRNA比例，并翻译产生正常的β
‑
珠蛋白。
[0010]本专利技术针对致病位点的移码突变，靶向切割目标DNA并引入缺失供体实现不依赖同源重组的高效修复。在临床上，只需将基因编辑后较高修复比例的自体造血干细胞移植回体内，便可达到治愈的目的。
[0011]本专利技术提供的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：将短的DNA片段插入特定DNA区域，改变靶标DNA序列。
[0012]进一步，在本专利技术提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：所述短的DNA片段包括2
‑
15个碱基。
[0013]进一步，在本专利技术提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：包括以下步骤：
[0014]步骤1，设计并制备能够识别并引导核酸酶至缺陷细胞的向导RNA，所述向导RNA为能够引导核酸酶在所述缺陷细胞DNA异常突变位点上游切割所述缺陷细胞DNA的向导RNA；
[0015]步骤2，采用基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：将短的DNA片段插入特定DNA区域，改变靶标DNA序列。2.根据权利要求1所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：所述短的DNA片段包括2
‑
15个碱基。3.根据权利要求1所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，设计并制备能够识别并引导核酸酶至缺陷细胞的向导RNA，所述向导RNA为能够引导核酸酶在所述缺陷细胞DNA异常突变位点上游切割所述缺陷细胞DNA的向导RNA；步骤2，采用基因编辑技术靶向所述缺陷细胞DNA异常突变位点造成双链断裂，同时提供短的DNA片段：向所述缺陷细胞中引入所述向导RNA、所述向导RNA能够识别并引导的核酸酶和所述短的DNA片段，所述向导RNA引导所述核酸酶在所述缺陷细胞DNA异常突变位点上游切割所述缺陷细胞DNA，并插入所述短的DNA片段进行非同源末端连接修复。4.根据权利要求3所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：所述缺陷细胞为G0期原代细胞。5.根据权利要求4所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：所述缺陷细胞为造血干细胞HBB基因的G0期原代细胞。6.根据权利要求5所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：所述向导RNA为能够引导核酸酶在密码子41/42(
‑
TCTT)位点上游1个碱基处切割所述造血干细胞DNA的向导RNA。7.根据权利要求6所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：所述向导RNA的靶向序列为以下序列中的任意一种或多种：TCCCCAAAGGACTCAACCTC；CCCCAAAGGACTCAACCTCT；GGACTCAACCTCTGGGTCCA；GACTCAACCTCTGGGTCCAA；GACCCAGAGGTTGAGTCCTT；ACCCAGAGGTTGAGTCCTTT；CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG。8.根据权利要求3
‑
7任一权利要求所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：所述向导RNA为碱基经过化学修饰的RNA。9.根据权利要求4所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：所述短的DNA片段为包括正常的HBB基因缺失的密码子41/42(
‑
TCTT)对应序列的双链片段，且所述短的DNA片段为两条互补的单链短片段oligo退...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴宇轩，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：