本发明专利技术公开了一种曲舍林剂量预测的快速反应试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述检测试剂盒用于检测曲舍林代谢标志物CYP2C19 681G>A和CYP2C19 636G>A两个基因的基因多态性，试剂盒包括如下组分：CYP2C19 681G>A扩增引物、CYP2C19 681G>A测序引物、CYP2C19 636G>A扩增引物、CYP2C19 636G>A测序引物和阳性对照。本发明专利技术采用多重RPA扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对曲舍林药物疗效预测相关的基因多态性进行检测，试剂盒可同时检测CYP2C19(681G>A)、CYP2C19(636G>A)基因多态性，为临床个性化用药给出基因角度的建议。个性化用药给出基因角度的建议。个性化用药给出基因角度的建议。
【技术实现步骤摘要】
一种曲舍林剂量预测的快速反应试剂盒及其检测方法和应用
[0001]本专利技术涉及一种曲舍林剂量预测的快速反应试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。
技术介绍
[0002]曲舍林是一种选择性5
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羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)，通过减少突触前5
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羟色胺再摄取而增加血清素能活性。曲舍林是儿科患者中因各种适应症使用的常见的抗抑郁药。曲舍林主要通过细胞色素P450 2C19(CYP2C19)酶代谢，而其他酶(例如细胞色素P450 2D6) 的贡献程度较小。CYP2C19的遗传变异导致CYP2C19功能的个体差异。PM个体在应用常规剂量药物时可能出现毒副反应，临床药物遗传学实施联合会(CPIC)指南建议考虑在 PM个体初始舍曲林剂量减少50％。EM和中间代谢者(intermediate metabolizer，IM)个体可给予常规剂量。
[0003]CYP2C19遗传变异可导致酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者(ultrarapidmetabolizer，UM)、快代谢者(extensive metabolizer，EM)、中间代谢者(intermediate metabolizer，IM)和慢代谢者(poor metabolizer，PM)4种表型。CYP2C19*2(rs4244285， c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4986893，c.636G>A)是中国人群中存在的2种导致CYP2C19 酶缺陷的主要等位基因。CYP2C19*2导致剪接缺失，CYP2C19*3为终止密码子突变。EM 个体只携带CYP2C19*1等位基因，IM个体携带CYP2C19*2或CYP2C19*3杂合子基因型； PM个体包括CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3基因型。东方人群中75～85％的PM由CYP2C19*2所致，约20～25％的PM由CYP2C19*3所致。CYP2C19酶存在基因多态性,能引起个体和种族间对曲舍林表现出不同代谢能力,使血药浓度呈现显著个体差异。
[0004]目前，对于基因多态性检测的方法主要有直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测条件要求严格。Taqman荧光探针法其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉的检测基因多态性的方法。
技术实现思路
[0005]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是获得一种曲舍林剂量预测的快速反应试剂盒及其检测方法和应用。
[0006]为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的曲舍林剂量预测的快速反应试剂盒的技术方案如下：
[0007]本专利技术的快速反应试剂盒针对CYP2C19(681G>A)、CYP2C19(636G>A)两个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、CYP2C19 (681G>A)测序引物、CYP2C19(636G>A)测序引物、阳性对照。
[0008]优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：
[0009][0010]优选的，所述CYP2C19(681G>A)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQID NO:2所示；所述CYP2C19(636G>A)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQID NO:4所示。
[0011]优选的，所述的CYP2C19(681G>A)测序引物、CYP2C19(636G>A)测序引物分别如序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。
[0012]更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。与DNA结合较DNA/DNA的结合更为稳定。
[0013]优选的，CYP2C19(681G>A)测序引物对应的测序区域为CYP2C19(681G>A)待检序列，如序列表SEQ ID NO:7所示；CYP2C19(636G>A)测序引物对应的测序区域为 CYP2C19(636G>A)待检序列，如序列表SEQ ID NO:8所示。
[0014]优选的，CYP2C19(681G>A)和CYP2C19(636G>A)共用一个分配指令如序列表SEQID NO:9所示。
[0015]优选的，所述的扩增反应液，包括，CYP2C19(681G>A)和CYP2C19(636G>A)特异性扩增引物，还包括血液样品直扩PCR预混液(2
×
)、海藻糖；
[0016]更优选的，反应液各组分终浓度分别为CYP2C19(681G>A)前引物(0.2uM)，CYP2C19 (681G>A)后引物(0.2uM)，CYP2C19(636G>A)前引物(0.25uM)，CYP2C19(636G>A) 后引物(0.25uM)，PCR预混液(1
×
)，海藻糖(0.2％)；
[0017]优选的，所述的PCR预混液为Blood Direct PCR Master Mix(2
×
)，含有耐血的HemoTaq TM
DNA聚合酶，对全血中血红素等各种PCR抑制剂表现出超强的抗性。
[0018]优选的，为获得最高的检测灵敏度，20μl的PCR扩增体系中最大加入的血液量可以达到4μl，即20％体积。
[0019]优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的CYP2C19*2*3型基因组DNA，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
[0020]优选的，所述的反应体积为20ul，反应条件为：预变性温度设为95℃，预变性时间设为5min，变性温度设为95℃，变性时间设为0s，退火延伸温度设为58℃，退火延伸时间设为0s，扩增35个循环。
[0021]优选的，扩增所采用的PCR管密封薄膜，在PCR反应孔处具有与加热柱匹配的凹陷设计，其厚度为85μm，贴合度高，热传递快。更优选的，PCR管密封薄膜具穿透性，可用移液器枪头或探针穿透进行产物回收。
[0022]本专利技术还公开了一种采用上述试剂盒的曲舍林剂量预测相关的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0023]a.将所述扩增反应液与4ul待测EDTA抗凝本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种曲舍林剂量预测的快速反应试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测曲舍林代谢标志物CYP2C19 681G>A和CYP2C19 636G>A两个基因的基因多态性，试剂盒包括如下组分：CYP2C19 681G>A扩增引物、CYP2C19 681G>A测序引物、CYP2C19 636G>A扩增引物、CYP2C19 636G>A测序引物和阳性对照。2.根据权利要求1所述的曲舍林剂量预测的快速反应试剂盒，其特征在于，所述CYP2C19 681G>A扩增引物如序列表SEQ ID NO:1～2所示。3.根据权利要求1所述的曲舍林剂量预测的快速反应试剂盒，其特征在于，所述CYP2C19 636G>A扩增引物如序列表SEQ ID NO:3～4所示。4.根据权利要求1所述的曲舍林剂量预测的快速反应试剂盒，其特征在于，所述所述CYP2C19 681G>A测序引物如序列表SEQ ID NO:5所示，CYP2C19 636G>A测序引物如序列表SEQ ID NO:6所示。5.根据权利要求1所述的曲舍林剂量预测的快速反应试剂盒，其特征在于，所述所述测序引物为琼脂糖凝胶颗粒与氨基标记的DNA序列的结合物。6.根据权利要求1所述的曲舍林剂量预测的快速反应试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括血液样品直扩PCR预混液和海藻糖。7.根据权利要求6所述的曲舍林剂量预测的快速反应试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分终浓度为：CYP2C19(681G>A)前引...
【专利技术属性】
技术研发人员：张玉，曾芳，周涛，龚卫静，
申请(专利权)人：湖南菲思特精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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