一种crRNA及用于CRISPR-Cas12a检测人腺病毒核酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种crRNA分子及用于CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种crRNA及用于CRISPR
‑
Cas12a检测人腺病毒核酸的方法


[0001]本专利技术公开了一种crRNA分子及检测人腺病毒核酸的方法，属于核酸检测


技术介绍

[0002]人腺病毒(human adenovirus,HAdV)感染人体可引起多种疾病。呼吸道是腺病毒侵袭并引发症状的常见部位，造成发热、肺炎、支气管炎等症状。呼吸道腺病毒在人群中普遍易感，在临床上常见，一年四季均可流行，在我国北方以冬春季常见，南方以春夏季常见。人腺病毒在密闭、拥挤和潮湿的环境，如军营、学校、托幼机构、医疗机构等常可引起暴发流行。能引起人呼吸道感染的人腺病毒主要包括B、C、E三个亚群，其中B群包括腺病毒3、7、14、55型等，C群包括腺病毒的1、2、 5、6型，E群的4型。其中人腺病毒B群中的HAdV
‑
3和HAdV
‑
7型是我国最主要流行的人腺病毒型别；B群的HAdV
‑
55型已在我国发现容易引发重症病例。其它型别的呼吸道HAdV出现的频率较低或引起症状较轻。
[0003]呼吸道疫情发生后，进行针对腺病毒的快速诊断是十分必要的。核酸检测具有灵敏、快速、准确等特点，是重要且常用的呼吸道腺病毒检测技术之一，包括PCR、荧光定量PCR等。
[0004]CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 全称为“簇状、规律间隔的、短回文重复序列”，随着CRISPR
‑
Cas机理和新Cas酶的逐步揭示，研究人员发现这个系统非常强大，不仅可以精准高效地实现基因编辑，新发现的Cas12a还可以用于核酸检测，实现病原体的快速诊断。CRISPR
‑
Cas12a系统通过转录表达形成Cas12a
‑
crRNA复合体，crRNA引导cas12a核酸酶特异性识别并剪切双链DNA，随后Cas12a 的非特异剪切活性被立即激活，随机剪切降解单链DNA。基于该原理，将单链DNA制备成荧光淬灭探针，可以通过荧光信号的释放实现对目的序列的特异性检测。加州大学伯克利分校的研究员Jennifer Doudna将核酸扩增技术和基于CRISPR
‑
Cas12a的核酸检测技术进行结合，将核酸扩增的结果进一步放大，实现检测灵敏度的倍增。由于CRISPR
‑
Cas12a的 crRNA对目的序列的识别受PAM序列(TTTN或TTN)和碱基互补配对原则的双重限制，因此CRISPR
‑
Cas12a在发挥高灵敏度检测功能的同时还能够保证高特异度。该技术在Science上公布后立即引发世界范围内高度关注。美国国防高级研究计划局(DARPA)计划将基于CRISPR系统核酸检测技术应用于病原体的快速甄别。
[0005]可以预见，基于CRISPR
‑
Cas12a系统的高灵敏、高特异核酸检测技术将在病原体诊断领域发挥巨大作用。2019年中国疾病预防控制中心组织多学科专家，制定了《人腺病毒呼吸道感染预防控制技术指南(2019 年版)》，并发布于《中华预防医学杂志》上。该指南明确将核酸检测作为诊断腺病毒的主要方式之一。鉴于我国主要流行的人腺病毒以B亚群为主，本专利技术的目的就是提供一种针对B亚群中3、7、14、55型人腺病毒的高敏感、高特异PCR
‑
Cas12a核酸检测技术，为人呼吸道腺病毒的检测和监测提供新方法。

技术实现思路

[0006]基于上述目的，本专利技术首先提供了一种用于CRISPR
‑
Cas12a技术检测人腺病毒核酸的crRNA分子，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.1 所示。
[0007]其次，本专利技术还提供了一种应用上述crRNA分子基于非诊断目的的 CRISPR
‑
Cas12a技术检测人腺病毒核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
[0008](1)制备样本核酸模板；
[0009](2)使步骤(1)获取的核酸模板，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及所述crRNA分子在CRISPR
‑
Cas12a 技术检测体系里反应；
[0010](3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。
[0011]在一个优选的实施方案中，步骤(1)所述的样本核酸模板由PCR 扩增方法制备。
[0012]在一个更为优选的实施方案中，所述PCR扩增的上游引物的序列含有SEQ ID NO.8所示的序列，所述PCR扩增的下游引物的序列含有SEQID NO.9所示的序列。
[0013]更为优选的，所述PCR扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.8所示，所述PCR扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.9所示。
[0014]在一个优选的实施方案中，步骤(2)所述CRISPR
‑
Cas12a检测体系中，所述DNA探针的序列如SEQ ID NO.11所示，在一个更为优选的实施方案中，所述荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ。
[0015]第三，本专利技术还提供了一种CRISPR
‑
Cas12a技术检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的crRNA分子，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及序列含有SEQ ID NO.8所示序列的PCR 扩增上游引物，序列含有SEQ ID NO.9的PCR扩增的下游引物。
[0016]在一个更为优选的实施方案中，所述PCR扩增的上游引物的序列由 SEQ ID NO.8所示，所述PCR扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.8所示。
[0017]在一个优选的实施方案中，所述试剂盒中的DNA探针的序列如SEQID NO.11所示。
[0018]第四，本专利技术提供了一种用于制备上述crRNA分子的上游DNA单链和下游DNA单链，所述上游DNA单链的序列如SEQ ID NO.12所示，所述下游DNA单链的序列如SEQ ID NO.13
‑
15任一所示。
[0019]最后，本专利技术提供了一种用于制备上述crRNA分子的方法，在所述方法中，先使序列如SEQ ID NO.12所示或其互补序列的上游DNA单链和序列如SEQ ID NO.13
‑
15中任一所示或其互补序列的下游DNA单链进行杂交制备DNA体外转录模板，再根据所述DNA体外转录模板制备所述crRNA。
[0020]本专利技术提供的CRISPR
‑
Cas12a技术检测人腺病毒核酸的方法简便易行快速，针对样本核酸一步即可完成检测，仅需30
‑
45min便于基层的快速检测。当结合PCR扩增技术时，即PCR
‑
Cas12a检测技术放大了PCR 核酸扩增信号，灵敏度为100copies/μl，优于PCR核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于CRISPR
‑
Cas12a技术检测人腺病毒核酸的crRNA分子，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种应用权利要求1所述crRNA分子基于非诊断目的的CRISPR
‑
Cas12a技术检测人腺病毒核酸的方法，所述方法包括以下步骤：(1)制备样本核酸模板；(2)使步骤(1)获取的核酸模板，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及所述crRNA分子在CRISPR
‑
Cas12a技术检测体系里反应；(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的样本核酸模板由PCR扩增方法制备。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的上游引物的序列含有SEQ ID NO.8所示的序列，所述PCR扩增的下游引物的序列含有SEQ ID NO.9所示的序列。5.根据权利要求1
‑
4任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.11所示。6.一种CRISPR
‑
Cas12a...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱少富，刘鸿博，宋宏彬，王立贵，杜昕颖，向莹，杨明娟，杨超杰，刘洪波，王辉，王琪，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：