一种蜱传非洲猪瘟病毒三重荧光定量PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种蜱传非洲猪瘟病毒三重荧光定量PCR检测试剂盒，包含PCR反应液、热启动Taq DNA聚合酶、探针法荧光定量PCR配套Buffer、蜱虫18S rRNA基因特异性引物和荧光探针、非洲猪瘟病毒B646L基因特异性引物和荧光探针、猪COX1基因特异性引物和荧光探针、无核酶的水、对照品等。本发明专利技术的试剂盒是一种新颖，快速，高度灵敏且特异的三重荧光定量PCR检测试剂盒，可同时检测样本中是否存在蜱虫、非洲猪瘟病毒以及猪的基因组。对三种基因组的检测限满足实际需求，可用于常规实验室诊断蜱传非洲猪瘟病毒，并且通过对临床样本的检测验证了该试剂盒的实用性和可靠性。该试剂盒的实用性和可靠性。

【技术实现步骤摘要】
一种蜱传非洲猪瘟病毒三重荧光定量PCR检测试剂盒


[0001]本专利技术属于生物技术，涉及一种蜱传非洲猪瘟病毒三重荧光定量PCR检测试剂盒及应用，是一种可同时检测蜱虫、非洲猪瘟病毒和猪基因组的三重荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，可短时间内完成对三种基因组的检测。在检测非洲猪瘟病毒的同时，可为蜱虫的宿主分析和非洲猪瘟病毒的溯源研究提供科学依据。

技术介绍

[0002]蜱虫广泛分布于世界各个地区，各生长阶段都需要寻找合适的宿主吸血。蜱虫最严重的危害是其体内携带的多种病原体可在吸血及更换宿主的过程中广泛传播。蜱虫可传播多种病毒、细菌、原虫等病原体，非洲猪瘟病毒被证明是其中一种，该病毒的传播途径包括经由蜱虫等生物媒介传播。所以快速并准确诊断蜱虫是否携带和传播非洲猪瘟病毒，是控制和预防该传染病的重要步骤。
[0003]非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，严重危害全球养猪业。该病病程极短，死亡率极高。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，中国将其列为一类动物疫病，也是最复杂的传染病之一。目前非洲猪瘟尚无有效疫苗、无有效的治疗措施，控制只能依靠检测加上扑杀。
[0004]近年来，非洲猪瘟的危害程度呈上升趋势，在世界范围内形成了相当大的扩散面和污染面。我国当前防控形势仍然复杂严峻，境外疫情传入风险增加。非洲猪瘟病毒的快速并有效的检测是预防和控制疾病流行的重要前提。然而，蜱虫作为非洲猪瘟病毒的储存宿主和生物载体，研究其在病毒传播中的作用具有重要意义。非洲猪瘟病毒检测方法集中于常规PCR技术和荧光定量PCR技术，这两种方法都是OIE推荐的，其灵敏度高、特异性强、重复性好，适合特定病毒的检测。为解决所述问题，本专利技术开发了一种新颖、高效、高度灵敏且特异的三重荧光定量PCR检测试剂盒，满足实际检测蜱传非洲猪瘟病毒的应用需求，有望可以成为控制和预防非洲猪瘟疫病的实用型诊断工具。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种蜱传非洲猪瘟病毒三重荧光定量PCR检测试剂盒，具有良好特异性、较高敏感性和稳定性。
[0006]本专利技术试剂盒包含：PCR反应液，热启动Taq DNA聚合酶，探针法荧光定量PCR配套Buffer，三对特异性引物和相应的探针，无核酶的水、对照品(包括标准品阳性对照和阴性对照)。其中，PCR反应液含有Mg
2+
离子、PCR缓冲液、dNTPs混合物等荧光定量PCR体系所必需的组分。对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为带有蜱虫、非洲猪瘟病毒和猪基因组DNA片段的标准品模板，阴性对照为无核酶的水。
[0007]三重荧光定量PCR检测试剂盒中用于鉴定蜱虫基因组的18S rRNA基因特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，
下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，荧光探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；
[0008]用于鉴定非洲猪瘟病毒的B646L基因特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示，荧光探针的碱基序列如SEQ ID NO.6所示；
[0009]用于鉴定猪基因组的COX1基因特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.8所示，荧光探针的碱基序列如SEQ ID NO.9所示。
[0010]阳性标准品目的基因的具体序列见序列表SEQ ID No.10
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12。检测蜱虫基因组的18SrRNA基因片段具有SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；检测非洲猪瘟病毒基因组的B646L基因片段具有SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；而检测猪基因组的COX1基因片段具有SEQ ID No.12所示的核苷酸序列。分别将三种目的基因扩增，连入pMD19
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T载体，构建重组质粒用作标准品模板。
[0011]本试剂盒保存于
‑
20℃，并尽量减少反复冻融次数。
[0012]本专利技术的另一个目的是提供所述试剂盒在检测蜱虫、非洲猪瘟病毒和猪基因组中应用，通过以下步骤实现：
[0013]步骤一：利用“白布拖拉法”实地野外采集蜱虫或从动物身上摘取蜱虫样品，每一只蜱虫放入一个1.5ml无菌离心管中；
[0014]步骤二：按照基因组提取试剂盒说明书进行操作，提取和纯化样品中的DNA。首先将采集的蜱虫用无水乙醇洗净并捣碎，加入200μl缓冲液GA(或磷酸盐缓冲液)制成细胞悬液。再经蛋白酶K水浴消化3h。加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心以去除管盖内壁的水珠；加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，简短离心以去除管盖内壁的水珠；将所得溶液和絮状沉淀都转移至一个置于收集管中的吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉废液；加入500μl缓冲液GD(使用前确保加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液；加入600μl漂洗液PW(使用前确保加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液；重复上一步骤；12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3室温放置数分钟；将吸附柱转移到一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50μl洗脱缓冲液TE，室温放置2
‑
5min，12000rpm离心2min。最后每一份提取的蜱虫基因组DNA由洗脱缓冲液洗脱，可以直接使用或于
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20℃冻存备用；
[0015]步骤三：以所述步骤二中提取的蜱虫样品基因组DNA作为待检测模板，在荧光定量PCR反应液中加入设计好的多对引物和探针，在一个反应管中进行三重荧光定量PCR扩增反应。所述扩增反应体系混合液的组分及其体积如下所示：10μl Probe Master Mix(含有Mg
2+
离子、dNTPs混合物、热启动Taq DNA聚合酶等)，2μl模板DNA，检测18S基因的上下游引物各0.8μl，探针0.4μl；检测非洲猪瘟病毒B646L基因的上下游引物各0.8μl，探针0.4μl；检测COX1基因的上下游引物各0.8μl，探针0.8μl(所用的引物和探针的浓度为10μM)，无核酶的水1.6μl。所述的反应混合液在荧光定量PCR仪运行的扩增反应程序为：37℃污染消化2min，95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火延伸30s，重复循环进行上述的变性和退火延伸程
序共40次。在最优反应混合物和程序下，进行三重荧光定量PCR检测反应；
[0016]步骤四：选择荧光定量PCR仪所有荧光检测通道开放，FAM、VIC、ROX为多重反应同时测试，设定阈值，由电脑分析并得到Ct值。根据得到扩增曲线和读取的Ct值进行结果判定。
[0017]作为本专利技术的进一步说明，对于三种基因组所述的结果判定方法是根据扩增曲线和生成的Ct值，当Ct值≤3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蜱传非洲猪瘟病毒三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包含PCR反应液、热启动Taq DNA聚合酶、探针法荧光定量PCR配套Buffer、蜱虫18S rRNA基因特异性引物和荧光探针、非洲猪瘟病毒B646L基因特异性引物和荧光探针、猪COX1基因特异性引物和荧光探针、无核酶的水、对照品，其中，PCR反应液含有Mg
2+
离子、PCR缓冲液、dNTPs混合物；其中18S rRNA基因特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；荧光探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；其中B646L基因特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；荧光探针的碱基序列如SEQ ID NO.6所示；其中COX1基因特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.7所示；下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.8所示；荧光探针的碱基序列如SEQ ID NO.9所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为带有蜱虫、非洲猪瘟病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜爱芳，王钊，马光旭，杨怡，陈学秋，阳毅敏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：