一种用于冠状病毒检测分型的多重RT-PCR试剂盒、方法及引物组技术

本发明专利技术公开了一种用于冠状病毒检测并分型的多重RT-PCR试剂盒、使用方法及其专用的引物组，该试剂盒采用单管多重反转录PCR结合毛细电泳片段分析方法针对人呼吸道样本检测并区分人易感冠状病毒，包括2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。本发明专利技术的冠状病毒分型检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP-UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。致的假阳性结果出现。致的假阳性结果出现。

【技术实现步骤摘要】
一种用于冠状病毒检测分型的多重RT-PCR试剂盒、方法及引物组


[0001]本专利技术涉及病毒核酸检测
，具体涉及一种针对人呼吸道 样本进行七种人易感冠状病毒检测并分型的多重RT-PCR试剂盒及其 使用方法以及专用的引物组合。

技术介绍

[0002]冠状病毒属于巢状病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，因电镜下 病毒颗粒形式类似于王冠而得名，能感染从哺乳动物到禽类等一大批 脊椎动物，到目前为止共发现七种能够感染人体的冠状病毒，分别为 2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、 人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、 人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。在这七种 冠状病毒种，HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、HCoV-OC43 呈全球性分布及在人群中普遍存在，通常引起呼吸道感染，特别是婴 幼儿，临床症状为发热，流涕，咳嗽等，严重者可能出现毛细支气管 肺炎，肺炎，喉炎等症状。SARS-CoV于2003年爆发，共造成全球 8422人感染，916人死亡，临床症状为严重的急性呼吸道感染导致呼 吸衰竭并最终导致死亡。MERS-CoV于2012年及2015年呈现地域 性流行趋势，在26个国家中共有1618人感染，579人死亡，临床症 状为重症呼吸道感染导致的肾功能衰竭而死亡。截止2020年3月， SARS-CoV-2在全球范围内已有10余万人感染，其中死亡4000多人， 主要临床表现为发热、乏力、干咳、呼吸困难等，部分患者病症轻微， 可无发热，但也出现少量重症患者，其表现为急性呼吸窘迫综合征、 脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒及出凝血功能障碍等。
[0003]由于针对不同冠状病毒感染患者的诊疗方式存在本质区别，使得 冠状病毒分型具有潜在临床价值，特别是在SARS-CoV-2爆发期间， 通过冠状病毒分型检测将不同感染源的患者进行分流，集中医疗资源 对SARS-CoV-2感染者进行针对性治疗，有助于提升治愈率，同时阻 止疫情蔓延。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是克服
技术介绍
的技术缺陷，提供一 种用于冠状病毒检测分型的多重RT-PCR试剂盒及其使用方法以及专 用的引物组合，该试剂盒采用单管多重RT-PCR同时检测 SARS-CoV-2S基因和ORF1ab基因、HCoV-NL63 ORF1ab基因、 SARS-CoV ORF1ab基因、HCoV-HKU1 ORF1ab基因、HCoV-229E ORF1ab基因、MERS-CoV ORF1ab基因、HCoV-OC43 ORF1ab基因 和人内参B2M基因，区分呼吸道样本中不同型别的冠状病毒。本发 明的冠状病毒分型检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好， 能通过对人内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量 监控，并利用dUTP-UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的 假阳性结果出现。
[0005]本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0006]本专利技术所提供的一种用于冠状病毒分型的多重RT-PCR检测试剂 盒包含RT-PCR反
应液、引物组、RT-PCR酶液、阳性对照以及阴性 对照。其中RT-PCR反应液包括多重RT-PCR反应所需的dNTPs、 dUTP、Mg
2+
、缓冲液(表1)。
[0007]表1 RT-PCR反应液试剂组成(50人份)
[0008][0009][0010]其中引物组包含用于扩增SARS-CoV-2S基因和ORF1ab基因、 HCoV-NL63 ORFlab基因、SARS-CoV ORFlab基因、HCoV-HKU1 ORF1ab基因、HCoV-229E ORF1ab基因、MERS-CoV ORF1ab基因、 HCoV-OC43 ORF1ab基因和人内参B2M基因的引物，引物序列信息 如表2所示，引物组组成如表3所示。由上述正反向引物和衍生序列 也属于本
技术实现思路
，所述衍生序列是指在SEQ ID NO：1～18的基础上， 在序列的5
’
端或3
’
端添加或减少一个或多个碱基得到的序列。
[0011]表2 用于冠状病毒分型的引物序列
[0012][0013][0014]表3 引物组组成(50人份)
[0015][0016][0017]所述引物组中，用于扩增SARS-CoV-2S基因的正向引物，如SEQ ID NO：1所示的5
’
端添加荧光报告基团FAM；用于扩增SARS-CoV-2 ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：3所示的5
’
端添加荧光报告 基团FAM；用于扩增HCoV-NL63 ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：5所示的5
’
端添加荧光报告基团FAM；用于扩增SARS-CoV ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：7所示的5
’
端添加荧光报告 基团FAM；用于扩增HCoV-HKU1 ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：9所示的5
’
端添加荧光报告基团FAM；用于扩增HCoV-229E ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：11所示的5
’
端添加荧光报 告基团FAM；用于扩增MERS-CoV ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：13所示的5
’
端添加荧光报告基团FAM；用于扩增HCoV-OC43 ORF1ab基因的正向引物，如SEQ ID NO：15所示的5
’
端添加荧光报 告基团FAM；用于检测人内参B2M基因的正向引物，如SEQ ID NO：17所示的5
’
端添加荧光报告基团FAM。
[0018]其中RT-PCR酶液中包含逆转录酶、热启动DNA聚合酶和UNG 酶，其组分配比详见表4。
[0019]表4 RT-PCR酶液各组分配比(50人份)
[0020][0021]其中阳性对照为包含SARS-CoV-2S基因和ORF1ab基因、 HCoV-NL63 ORF1ab基因、SARS-CoV ORF1ab基因、HCoV-HKU1 ORF1ab基因、HCoV-229E ORF1ab基因、MERS-CoV ORF1ab基因、 HCoV-OC43 ORF1ab基因和人内参B2M基因序列的重组质粒；所述 冠状病毒分型检测阴性对照为RNase-free H2O。
[0022]进一步地，所述试剂盒的检测方法为通过对人呼吸道样本进行采 集和RNA提取，配制扩增反应体系后进行多重反转录PCR扩增，并 对获得的扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳图谱进行冠状病 毒分型判断；具体使用方法包括以下步骤：
[0023](1)采用核酸自动提取仪对采集的呼本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于冠状病毒检测分型的引物组，其特征在于，所述引物组包括用于扩增SARS-CoV-2 S基因和ORF1ab基因、HCoV-NL63 ORF1ab基因、SARS-CoV ORF1ab基因、HCoV-HKU1 ORF1ab基因、HCoV-229E ORF1ab基因、MERS-CoV ORF1ab基因、HCoV-OC43 ORF1ab基因和人内参基因B2M的引物。2.如权利要求1所述的一种用于冠状病毒检测分型的引物组，其特征在于，所述用于扩增SARS-CoV-2 S基因的正向引物序列为5
’-
CGGCCTTACTGTTTTGCCAC-3
’
，如SEQ ID NO：1所示，反向引物序列为5
’-
CTGCACCAAAGGTCCAACCA-3
’
，如SEQ ID NO：2所示；所述用于扩增SARS-CoV-2 ORF1ab基因的正向引物序列为5
’-
AGTGGGGGACAACCAATCAC-3
’
，如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列为5
’-
ACAGACAACACGATGCACCA-3
’
，如SEQ ID NO：4所示；所述用于扩增HCoV-NL63 ORF1ab基因的正向引物序列为5
’-
GCAACGTTCTGTCGTTGTGG-3
’
，如SEQ ID NO：5所示，反向引物序列为5
’-
CCTGAAAACCTTGTGCAGCG-3
’
，如SEQ ID NO：6所示；所述用于扩增SARS-CoV ORF1ab基因的正向引物序列为5
’-
CAGTCTTGCAGGCTGTAGGT-3
’
，如SEQ ID NO：7所示，反向引物序列为5
’-
ACATCACAACCTGGGGCATT-3
’
，如SEQ ID NO：8所示；所述用于扩增HCoV-HKU1 ORF1ab基因的正向引物序列为5
’-
GCTAATGGTGGTACTGGTTTTTGT-3
’
，如SEQ ID NO：9所示，反向引物序列为5
’-
ACACGCTGTCCATCTCTATCAT-3
’
，如SEQ ID NO：10所示；所述用于扩增HCoV-229E ORF1ab基因的正向引物序列为5
’-
TGTTGACAAATGGGATGATTTTTGC-3
’
，如SEQ ID NO：11所示，反向引物序列为5
’-
TCAACGACTTAAGCCAGTCTCT-3
’
，如SEQ ID NO：12所示；所述用于扩增MERS-CoV ORF1ab基因的正向引物序列为5
’-
GGAGGTACCAGTAGCGGAGA-3
’
，如SEQ ID NO：13所示，反向引物序列为5
’-
AGCAAACGACACCGTCATCA-3
’
，如SEQ ID NO：14所示；所述用于扩增HCoV-OC43 ORF1ab基因的正向引物序列为5
’-
TGTTGTTGGACCTGATGCGA-3
’
，如SEQ ID NO：15所示，反向引物序列为5
’-
TTAAAGGAAAGACGCGCTGC-3
’
，如SEQ ID NO：16所示；所述用于扩增人内参B2M基因的正向引物序列为5
’-
CCTGGAGGCTATCCAGCGTA-3
’
，如SEQ ID NO：17所示，反向引物序列为5
’-
TGCTTACATGTCTCGATCCCA-3
’
，如SEQ ID NO：18所示。3.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：余丁，朱浩威，卢文波，李贵霞，张迪骏，余道福，张成，王伟建，章壮，吴勇，
申请(专利权)人：宁波市妇女儿童医院，
类型：发明
国别省市：