检测非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因的引物对、探针、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、试剂盒，所述试剂盒包含针对SEQ ID NO：1所示非洲猪瘟病毒MGF360

【技术实现步骤摘要】
检测非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因的引物对、探针、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种基于MGF360-12L基因检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、试剂盒、及其应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)感染引起的一种猪急性、热性、高度接触性传染病。临床上主要以高热皮肤和内脏器官出血、共济失调和食欲废绝为主要特征，死亡率接近100％。非洲猪瘟是世界动物卫生组织(OIE)要求法定报告的动物疫病，我国动物病原微生物名录将其列为一类病。自2018年8月3日中国农村农业部在辽宁省确认非洲猪瘟疫情以来，非洲猪瘟已蔓延至32个省级行政区域，使得近120万头生猪遭到扑杀，对中国养猪业造成了巨大的经济损失，严重威胁畜牧业的健康发展，也给人类公共卫生造成了威胁。ASFV属于非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属，是该科的唯一成员。ASFV基因组大小170～190kb，是一种双股DNA病毒，编码160～175个基因。用编码VP72蛋白的B646L基因分析不同地区ASFV分离株，可以将ASFV流行株分为22个主要的基因型，其中流行于中国的主要是基因II型。
[0003]目前针对ASFV的检测技术主要分为两大类，即基于病毒抗体的免疫学检测方法和基于病毒核酸的PCR检测技术。针对ASFV的免疫学检测方法主要有红细胞吸附试验(HA)、直接荧光抗体试验(FAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。免疫学检测方法的优点在于可以准确反应病毒的发生和发展情况。但是，免疫学检测方法试验要求高、费用高、耗时长、敏感性较低。此外，ASFV感染早期并不会产生抗体，因此免疫学检测方法的使用受到了局限。近年来，荧光定量PCR由于敏感性高、特异性好、耗时短及定量准确等优点而逐渐被广泛应用。荧光定量PCR主要包括SYBR Green I法和TaqMan探针法，TaqMan探针法相对于SYBR Green I法具有更高的特异性，应用价值更高。
[0004]ASFV基因组庞大，其基因组中约30％的开放阅读框存在多个拷贝，即多基因家族(Multigene families,MGFs)，包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505(在Malawi分离株中命名为530)。MGF编码的多个拷贝提示病毒的选择进化可能与此相关。虽然对MGFs的功能尚待深入研究，但研究已证明MGF在病毒的感染过程中有重要作用。敲除ASFV强毒或弱毒株MGF360和530/505的某些基因将导致病毒在巨噬细胞或软蜱体内的复制效率下降，免疫动物后可以提供针对同源病毒或部分异源病毒的保护力；缺失MGF360的10L、11L、12L、13L、14L和MGF530/505-1R、-2R、-3R基因的弱毒株OURT88/3，在体内和体外均可激发较高水平的IFN(Interferon)表达，这种缺失毒株可以对某些基因型提供一定的攻毒保护能力；除此之外，同样缺失ASFV Benin 97/1毒株的上述基因，并使MGF360-9L与MGF 505-4R失活，以此缺失毒株感染猪巨噬细胞可检测到IFN-β的表达水平较原始毒株明显升高，而以这种缺失毒株免疫猪后可以提供一定的免疫保护，且这种保护还与病毒毒力成剂量相关。最近的研究表明，ASFV MGF360-12L是一种多功能宿主逃避蛋白，发挥免疫抑制功能通过多种机制实
现，包括抑制TBK1、IRF3、IKKβ和IRF9的蛋白表达水平，以抑制IFN-β的表达和IFN-β介导的JAK/STAT信号。这些都说明MGF360家族有很大的研究价值，有必要建立针对MGF360家族的检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决目前缺乏快速、准确检测非洲猪瘟病毒试剂盒的技术问题，提供一种荧光定量RT-PCR检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、及试剂盒，该试剂盒能快速、准确、灵敏、特异地对非洲猪瘟病毒(ASFV)进行检测。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:
[0007]在本专利技术的一个方面，提供了一种检测非洲猪瘟病毒的引物对，所述引物对是针对SEQ ID NO：1所示非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因序列或其部分序列设计的引物对。
[0008]优选的，所述引物对具有如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的碱基序列。
[0009]在本专利技术的另一方面，还提供了一种检测非洲猪瘟病毒的探针，所述探针是特异性针对SEQ ID NO：1所示非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因序列或其部分序列设计的探针。
[0010]优选的，所述探针具有如SEQ ID NO：4所示的碱基序列。
[0011]所述探针的5
’
端标记有荧光报告基团，所述探针的3
’
标记有荧光淬灭基团。
[0012]在本专利技术的另一方面，还提供了一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物对。
[0013]优选的，所述试剂盒还包含上述探针。
[0014]优选的，所述试剂盒还包含：含有SEQ ID NO：1所示非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因序列的阳性重组质粒标准品。
[0015]所述试剂盒采用荧光定量PCR方法进行检测。
[0016]优选的，所述荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火延伸10秒，40个循环。
[0017]本专利技术试剂盒不仅可用于检测非洲猪瘟病毒，而且还可用于鉴别区分MGF360-12L基因缺失的非洲猪瘟病毒弱毒疫苗株与非洲猪瘟野毒株的感染。
[0018]在本专利技术的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用。
[0019]本专利技术检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，通过基于非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法对非洲猪瘟病毒进行检测，最低可检测到790Copies/μL，其敏感度比常规PCR高10倍，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0020]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。
[0021]图1是本专利技术实施例1的标准品扩增曲线图；
[0022]图2是本专利技术实施例1的标准曲线图；
[0023]图3是本专利技术实施例3的敏感性试验结果图；
[0024]图4是本专利技术实施例4的China/2018/AnhuiXCGQ常规PCR敏感性测试结果图；
[0025]图5是本专利技术实施例5的特异性试验结果图。
具体实施方式
[0026]下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J，拉塞尔D W，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.分子克隆实验指南，第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
[0027]实施例1非洲猪瘟病毒TaqM本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测非洲猪瘟病毒的引物对，其特征在于，所述引物对是针对SEQ ID NO：1所示非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因序列或其部分序列设计的引物对。2.根据权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的引物对，其特征在于，所述引物对具有如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的碱基序列。3.一种检测非洲猪瘟病毒的探针，其特征在于，所述探针是特异性针对SEQ ID NO：1所示非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因序列或其部分序列设计的探针。4.根据权利要求3所述的检测非洲猪瘟病毒的探针，其特征在于，所述探针具有如SEQ ID NO：4所示的碱基序列。5.根据权利要求3或4所述的检测非洲猪瘟病毒的探针，其特征在于，所述探针的5
’

【专利技术属性】
技术研发人员：钱莺娟，陈鸿军，吴晓东，郑龙三，薛峰，戴建君，朱鸿飞，郭晓宇，薄宗义，王振忠，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：