用于去除人类宿主核酸的探针组合物和应用及微生物核酸纳米孔测序文库的构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其是涉及用于去除人类宿主核酸的探针组合物和应用及微生物核酸纳米孔测序文库的构建方法。本发明专利技术基于探针杂交捕获技术，基于人基因组上的重复序列高频区间设计探针，并使用这些探针反向捕获临床样本中的宿主序列，保留未结合上探针的序列用于下游测序，对真菌、细菌和病毒等微生物核酸分子取得了优异的富集效果。并进一步开发了适用于纳米孔测序的样本处理与建库流程，得到的微生物核酸纳米孔测序文库更加适合纳米孔测序的长读长特性。测序的长读长特性。测序的长读长特性。

【技术实现步骤摘要】
用于去除人类宿主核酸的探针组合物和应用及微生物核酸纳米孔测序文库的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及用于去除人类宿主核酸的探针组合物和应用及微生物核酸纳米孔测序文库的构建方法。

技术介绍

[0002]纳米孔测序具有高便携性、实时测序、测序长读长等优势，基于纳米孔测序平台的宏基因组测序正成为一种临床感染病原检测的重要手段。然而临床样本中包含大量来源于宿主的基因序列(>90％)，来自病原的基因序列占比极低,并且纳米孔测序平台的测序通量相较传统的二代测序平台更低，直接影响到了病原检测的灵敏度。因此在测序前对样本开展去除宿主核酸的操作就尤为重要。
[0003]目前常用的去除宿主核酸的方法可分为以下几种：1.DNA提取前去除宿主细胞。针对人细胞与病毒分离可采用滤网过滤、密度梯度离心的方法，仅适用于病毒颗粒的富集。针对人细胞与细菌的分离可采用基于皂苷的差异裂解法，原理是使用皂苷这一温和的裂解剂先裂解人的细胞，再用核酸酶降解释放的核酸，此时完整的细菌不受影响，后续再用强裂解剂裂解细菌。这一方法的缺点在于仅能富集具有完整结构的细菌，对于一些病毒、胞内菌或病原的游离核酸可能会在处理过程中丢失。2.DNA提取后从总核酸中分离微生物核酸。目前的方法基于CpG甲基化位点结合蛋白进行对包含CpG甲基化位点的序列进行靶向捕获并去除，原理在于CpG甲基化位点在人基因组上分布广泛，但在微生物基因组上分布较少，通过这样的分离步骤可降低样本中宿主序列的占比。
[0004]基于生物素标记探针的杂交捕获技术是一种常用的测序富集技术，通过设计与目标序列互补的探针将样本中的目标序列捕获下来用于下一步的测序，这一方法可以极大提升目标序列的占比。探针杂交捕获技术在人基因组上使用非常广泛，例如一些全外显子的探针panel可以实现对外显子序列的富集，用于某些疾病的诊断。但是，常规的探针杂交捕获主要用于目标序列的正向富集，将捕获下来的序列用于下一步应用，极少有使用探针进行目标序列的反向去除。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于，提供一种探针设计方法，用于获取去除人类宿主核酸的探针组合物，以期该探针组合物能够用于微生物核酸纳米孔测序文库的构建。
[0007]为了解决上述技术问题，实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供用于去除人类宿主核酸的探针组合物，所述探针组合物包括至少100条探针，所述探针靶向人基因组的重复序列，不同探针在人基因组上的间隔大于500bp，所述探针组合物中同时包括结合于正义链的正向探针和结合于反义链的反向探针，每条探针比对到人基因组的频次大于2000，比对到微生物基因组的频次小于10。
[0009]在可选的实施方式中，所述人基因组的核苷酸序列信息来源于NCBI数据库的人基因组GRch36(hg18)、GRch37(hg19)或GRch38(hg38)；
[0010]所述微生物基因组的核苷酸序列信息来源于NCBI的RefSeq数据库中收录的细菌基因组、真菌基因组或病毒基因组序列的数据库中的至少一种。
[0011]在可选的实施方式中，所述探针组合物包括451条探针，核苷酸序列如SEQ ID No:1～SEQ ID No:451所示。
[0012]第二方面，本专利技术提供前述实施方式任一项所述探针组合物的制备方法，所述制备包括，按照以下步骤获取探针组合物中每条探针的核苷酸序列，然后人工合成获得探针组合物：
[0013]S1、从基因数据库中获取来源于人类的重复核苷酸序列；
[0014]S2、利用探针设计软件设计第一组探针的核苷酸序列，所述第一组探针的核苷酸序列靶向S1得到的重复核苷酸序列；
[0015]S3、在S2获得的第一组探针中，选取比对到人基因组的频次大于2000，比对到微生物基因组的频次小于10的探针，得到第二组探针；
[0016]S4、将第二组探针对应于人基因组靶点，而后每隔500bp保留一条探针，得到第三组探针；
[0017]S5、将第三组探针中至少一条探针的核苷酸序列转换为其互补序列，得到第四组探针，即为探针组合物。
[0018]优选地，步骤S5得到的第四组探针中任意相邻的两条探针分别靶向正义链和反向链。
[0019]优选地，所述基因数据库选自msRepDB数据库(https://msrepdb.cbrc.kaust.edu.sa/pages/msRepDB/index.html，无版本号)、RepBase数据库(V.26.06)、Dfam数据库(V.3.3)或LongRepMarker(v2.0)数据库。
[0020]优选地，所述探针设计软件选自xGen Hyb Panel Design Tool(https://sg.idtdna.com/pages/tools/xgen
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hyb
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panel
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design
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tool)、Primer Premier 5、Agilent SureDesign(https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)或NimbleDesign(design.nimblegen.com)。
[0021]第三方面，本专利技术提供前述实施方式任一项所述探针组合物或采用前述实施方式所述制备方法制备得到的探针组合物在以下(a)～(c)任一项中的应用：
[0022](a)非诊断目的地富集微生物核酸；
[0023](b)制备富集微生物核酸的产品；
[0024](c)微生物核酸纳米孔测序文库的构建。
[0025]在可选的实施方式中，所述微生物包括细菌、真菌或病毒中至少一种。
[0026]第四方面，本专利技术提供富集微生物核酸的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于去除人类宿主核酸实现微生物核酸的富集；
[0027]所述试剂或试剂盒包括前述实施方式任一项所述探针组合物或采用前述实施方式所述制备方法制备得到的探针组合物。
[0028]第五方面，本专利技术提供了应用前述实施方式所述的试剂或试剂盒富集微生物核酸的方法，所述方法包括提取人类来源样本的总核酸，与探针组合物杂交后，使用磁珠将游离
探针和杂交探针去除，实现微生物核酸的富集。
[0029]优选地，探针组合物杂交之前，总核酸经过第一末端修复和第一接头连接。
[0030]优选地，杂交产物扩增前使用磁珠纯化去除游离探针和宿主DNA，扩增后使用磁珠纯化去除缓冲液成分。
[0031]优选地，第一末端修复之前，总核酸还经过打断处理；进一步优选地，总核酸打断的片段长度为6000～10000bps；更优选为8000bps。
[0032]优选地，使用试剂盒Ultra
TM
II DNA Library Prep Kit for Illumina进行扩增。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于去除人类宿主核酸的探针组合物，其特征在于，所述探针组合物包括至少100条探针，所述探针靶向人基因组的重复序列，不同探针在人基因组上的间隔大于500bp，所述探针组合物中同时包括结合于正义链的正向探针和结合于反义链的反向探针，每条探针比对到人基因组的频次大于2000，比对到微生物基因组的频次小于10。2.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，所述人基因组的核苷酸序列信息来源于NCBI数据库的人基因组GRch36(hg18)、GRch37(hg19)或GRch38(hg38)；所述微生物基因组的核苷酸序列信息来源于NCBI的RefSeq数据库中收录的细菌基因组、真菌基因组或病毒基因组序列的数据库中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的探针组合物，其特征在于，所述探针组合物包括451条探针，核苷酸序列如SEQ ID No:1～SEQ ID No:451所示。4.权利要求1～3任一项所述探针组合物的制备方法，其特征在于，所述制备包括，按照以下步骤获取探针组合物中每条探针的核苷酸序列，然后人工合成获得探针组合物：S1、从基因数据库中获取来源于人类的重复核苷酸序列；S2、利用探针设计软件设计第一组探针的核苷酸序列，所述第一组探针的核苷酸序列靶向S1得到的重复核苷酸序列；S3、在S2获得的第一组探针中，选取比对到人基因组的频次大于2000，比对到微生物基因组的频次小于10的探针，得到第二组探针；S4、将第二组探针对应于人基因组靶点，而后每隔500bp保留一条探针，得到第三组探针；S5、将第三组探针中至少一条探针的核苷酸序列转换为其互补序列，得到第四组探针，即为探针组合物；优选地，步骤S5得到的第四组探针中任意相邻的两条探针分别靶向正义链和反向链；优选地，所述基因数据库选自msRepDB数据库、RepBase数据库、Dfam数据库或LongRepMarker数据库；优选地，所述探针设计软件选自xGen Hyb Panel Design Tool、Primer Premier 5、Agilent SureDesign或NimbleDesign。5.权利要求1～3任一项所述探针组合物或采用...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏，林彦锋，杨朗，王凯英，李瑾慧，李沛翰，贾雷立，宋宏彬，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：