本发明专利技术提供了一种检测九种病原体的试剂盒、用途以及使用方法，这种试剂盒能对肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌，所述试剂盒中包括检测九种病原体进行检测。采用本发明专利技术中的试剂盒，通过试剂盒中的引物探针、PCR反应液、PCR酶液以及其他成分的结合、协同，最后得到一种快速、灵敏度高、特异性好以及避免假阴性的检测九种病原体试剂盒；在使用本发明专利技术中试剂盒时，提取时加入内标，并且在检测时在检测的三个孔中都加入与检测病原体相互协同的内标，保证了提取的精准性以及很好的避免了检测的假阴性。阴性。
【技术实现步骤摘要】
一种检测九种病原体的试剂盒、用途及使用方法
[0001]本专利技术属于基因检测领域，涉及一种检测九种病原体的试剂盒、用途及这种试剂盒的使用方法。
技术介绍
[0002]呼吸道感染在临床上极为常见，但由于引起呼吸道感染的病原体种类多种多样，特别是如何快速区分出是病毒感染还是细菌感染，快速准确对病原体进行鉴定对于临床诊疗以及防止药物滥用具有重要意义。传统的细菌培养分离鉴定方法是目前常规的细菌分离鉴定的检测方法，是基于细菌生长形态学以及细菌所特有的酶对营养基质分解能力的不同，利用其代谢产物核酸、产气等生化特性进行鉴定的一种方法，是细菌分离的金标准，但该方法需要培养分离，耗时长，一般需要24-48小时；鉴定生化试验繁杂，对于培养条件苛刻的细菌不但所需时间更长而且检出率低；细菌自动化鉴定系统虽然简化了手工操作，但仪器中数据库还不完善，模式军中数量有限，对于结果有疑问的仍然需要手工鉴定；细菌血清学抗体的检测是一种快速检测方法，但不同的抗体产生的时间是不同的；。基于Taqman探针的荧光定量PCR技术能够特异性对病原体核酸分子进行大量扩增，同时利用荧光信号的积累实现阴阳性结果判读，相比于以上方法，分子诊断灵敏度极高，能够基于不同病原体基因序列的差异性实现病原体种类鉴定以及亚型区分，在疾病的诊疗中具有明显优势。
[0003]目前，很多检测呼吸道细菌的PCR试剂盒都是单重的，多重的检测很多流行性的细菌比较少，因此如何让加入的引物不互相干扰、检测灵敏度、检测速度快也不低于单项PCR检测灵敏度并且避免假阴性成为一大技术难点，因此，开发一种检测速度快、灵敏度高、特异性好并且能够避免假阴性的检测呼吸道病原体的PCR试剂盒具有明显的临床意义以及潜在应用价值。
技术实现思路
[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种快速、灵敏度高、特异性好以及能够避免假阴性的检测九种病原体的试剂盒。
[0005]本专利技术提供了一种检测九种病原体试剂盒，所述九种病原体为以下九种，肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌，所述试剂盒中包括检测九种病原体的正向引物、反向引物和探针。
[0006]进一步的，试剂盒中的正向引物和反向引物如下所示：
[0007]检测所述肺炎支原体的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；
[0008]检测所述肺炎支原体的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；
[0009]检测金黄色葡萄球菌的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8
所示，探针序列如SEQ ID NO:9所示；
[0010]检测肺炎链球菌的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示，探针序列如SEQ ID NO:12所示；
[0011]检测流感嗜血杆菌的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示，探针序列如SEQ ID NO:15所示；
[0012]检测肺炎克雷伯氏菌的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示，探针序列如SEQ ID NO:18所示；
[0013]检测鲍曼不动杆菌的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示，探针序列如SEQ ID NO:21所示；
[0014]检测铜绿假单胞菌的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示，探针序列如SEQ ID NO:24所示；
[0015]检测大肠杆菌的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示，探针序列如SEQ ID NO:27所示。
[0016]进一步的，所述试剂盒还包括内标，所示内标的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示，探针序列如SEQ ID NO:30所示。
[0017]进一步的，所述探针的两端分别带有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团为FAM、ROX、VIC、TET和CY5中的一种，所述猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGBNFQ中的一种。
[0018]进一步的，所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括如下组分：Tris-HCl pH＝8.5 10-100mM，KCl 1-50mM，MgCl
2 6-12mM，dATP 0.5-2mM，dCTP0.5-2mM，dGTP 0.5-2mM，dUTP 2-4mM，SSB 0.5-3.0mg/mL。
[0019]进一步的，所述试剂盒PCR反应液包括如下组分：Tris-HCl pH＝8.5 50mM，KCl 30mM，MgCl
2 7.5mM，dATP 1mM，dCTP 1mM，dGTP 1mM，dUTP 2.5mM，SSB 2.0mg/mL。
[0020]进一步的，所述试剂盒还包括PCR酶液，所述PCR酶液包括如下组分：Hot Start Taq 4U/test，UNG 2U/test，Anti Taq 4U/test，DTT 0.5mg/mL。
[0021]进一步的，本专利技术中的Anti Taq为东洋纺生产的。
[0022]本专利技术还提供一种采用上述任意一种试剂盒用于检测肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌九种病原体的用途。
[0023]本专利技术还提供使用以上任意一种试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：
[0024]1)病原体提取；
[0025]2)PCR扩增：PCR反应体系如下：PCR反应液8μL；PCR酶液2μL；每种病原体和内标的正向引物和反向引物浓度分别为400nM；探针浓度分别为200nM；病原体提取产物10μL。
[0026]进一步的，所述PCR扩增中，采用三个检测孔，三个检测孔分别检测不同的病原体。
[0027]进一步的，本专利技术中PCR扩增步骤具体为：在检测仪器中使用三个检测孔，第一孔中加入肺炎支原体，肺炎衣原体，金黄色葡萄球菌正反引物对和内标，第二孔中加入肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，肺炎克雷伯氏菌正反引物对和内标，第三孔中加入鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌，大肠杆菌正反引物对和内标。
[0028]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：采用本专利技术中的试剂盒，通过试剂盒中的引物探针、PCR反应液、PCR酶液以及其他成分的结合、协同，最后得到一种快速、灵敏度高、
特异性好以及避免假阴性的检测九种病原体试剂盒；在使用本专利技术中试剂盒时，提取时加入内标，并且在检测时在检测的三个孔中都加入与检测病原体相互协同的内标，保证了提取的精准性以及很好的避免了检测的假阴性；本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测九种病原体试剂盒，其特征在于：所述九种病原体为以下九种，肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌，所述试剂盒中包括检测九种病原体的正向引物、反向引物和探针。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：检测肺炎支原体的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；检测肺炎衣原体的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，探针序列如SEQ ID NO:6所示；检测金黄色葡萄球菌的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，探针序列如SEQ ID NO:9所示；检测肺炎链球菌的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示，探针序列如SEQ ID NO:12所示；检测流感嗜血杆菌的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示，探针序列如SEQ ID NO:15所示；检测肺炎克雷伯氏菌的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示，探针序列如SEQ ID NO:18所示；检测鲍曼不动杆菌的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示，探针序列如SEQ ID NO:21所示；检测铜绿假单胞菌的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示，探针序列如SEQ ID NO:24所示；检测大肠杆菌的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示，探针序列如SEQ ID NO:27所示。3.如权利要求1或2任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括内标，所述内标的正向引物和反向引物序列如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示，探针序列如SEQ ID NO:30所示；优选的，所述探针的两端分别带有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团为FAM、ROX、VIC、TET...
【专利技术属性】
技术研发人员：周雪鹄，董璐，
申请(专利权)人：重庆中元汇吉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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