一种用于快速检测单核细胞增生李斯特菌的联合检测方法及其系统和应用技术方案

本发明专利技术属于食品安全检测和生物技术领域，具体涉及一种用于快速检测单核细胞增生李斯特菌的联合检测方法及其系统和应用。本发明专利技术首先提取单核细胞增生李斯特菌基因组DNA，通过RAA扩增获得携带T7启动子的DNA片段，经T7RNA聚合酶体外转录得到靶标RNA，当靶标RNA存在时，可激发Cas13a

【技术实现步骤摘要】
一种用于快速检测单核细胞增生李斯特菌的联合检测方法及其系统和应用


[0001]本专利技术属于食品安全检测和生物
，具体涉及一种用于快速检测单核细胞增生李斯特菌(以下简称“李斯特菌”)的联合检测方法及其系统和应用，即重组酶介导核酸等温扩增(RAA)和CRISPR/Cas13a联合检测方法。

技术介绍

[0002]单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM),简称单增李斯特菌，是兼性胞内寄生的人畜共患致病菌，属于需氧或兼性厌氧革兰氏阳性菌。该菌可穿透血脑屏障、肠道屏障和胎盘屏障，引起脑膜炎、败血症、胃肠炎、流产等病症；该菌可在低温环境中缓慢繁殖，是威胁冷藏食品的一种重要病原，世界卫生组织将其列为四大重要食源性致病微生物之一。因此，快速精准检测食品中的单增李斯特菌受到人们关注。
[0003]传统检测李斯特菌的方法包括：传统分离培养法、免疫学方法及分子生物学方法。传统分离培养法通过鉴别培养基进行检测和生化鉴定，虽操作简单，但耗时长、检测效率低；免疫学方法虽通量高、检测速度快，但当目标检测物含量较低时，易出现假阴性结果，检测灵敏度和特异性较差；PCR、荧光定量PCR等分子生物学方法灵敏度高，但其所需仪器昂贵，对操作人员要求较高，而且扩增检测时间至少需要2个小时，较难满足基层普及和现场需求。综上，有必要建立快速、特异、敏感、低成本的单增李斯特菌检测方法。

技术实现思路

[0004]为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种用于检测单增李斯特菌的重组酶介导核酸等温扩增(Recombinase Aided Amplification,RAA)和CRISPR/Cas13a联合检测方法，该方法特异性强、灵敏度高、操作简单、设备要求低，适用于食品安全检测等

[0005]一种用于快速检测单核细胞增生李斯特菌的联合检测方法，包括如下步骤：
[0006](1)利用携带T7启动子的特异引物和RAA扩增体系(重组酶、聚合酶和单链DNA结合蛋白)对细菌样本DNA进行38℃等温扩增，获得T7
‑
DNA目的片段；
[0007](2)针对目标基因的靶标设计向导RNA，即crRNA；
[0008](3)将商品化T7 RNA聚合酶、NTP、RAA产物、Cas13a蛋白、crRNA和荧光报告分子混合进行等温孵育，用荧光检测仪进行信号收集并记录。
[0009]其中，
[0010]步骤(1)携带T7启动子的扩增引物为：
[0011]上游引物F:TAATACGACTCACTATAGGGCCGAAGTTTACATTCAAGCTATTATTTAC；
[0012]下游引物R:TAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTG；
[0013]扩增片段为hly基因第258
‑
529位碱基，共272bp。
[0014]步骤(2)目标基因为检测系统中特异性靶向李斯特菌溶血素编码基因(hly基因)
的crRNA，序列为：
[0015]5’‑
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGUAAAUACAUUAGUGGAAAG
‑3’
，其中后半段序列GUAAAUACAUUAGUGGAAAG与靶标RNA序列互补。
[0016]步骤(3)所述转录方式为体外转录，孵育温度38℃，反应体系中的RAA产物(T7
‑
DNA)在T7 RNA聚合酶作用下形成携带靶标RNA的片段，该片段被Cas13a
‑
crRNA复合物中的crRNA特异性识别，Cas13a切割功能同时被激活，利用Cas13a激活后不受序列限制的RNA酶活性，剪切检测体系中加入的荧光报告分子，使之与淬灭基团分离，获得荧光并进行荧光信号采集，实现对目的基因的检测。
[0017]T7 RNA聚合酶体外转录与Cas13a蛋白反应在同一体系中进行，即将转录体系与Cas13a剪切体系共同混合，并置于38℃环境孵育，以简化实验操作。
[0018]另外，本申请提供了李斯特菌hly基因靶标序列及RAA扩增引物对、向导RNA及检测系统。
[0019]扩增李斯特菌hly基因靶标序列的RAA引物对，上游引物(F)包含T7启动子，扩增片段包含与crRNA互补的靶标序列，序列如下：
[0020]靶标RNA序列：
[0021]5’‑
CUUUCCACUAAUGUAUUUAC
‑3’
[0022]RAA扩增引物序列：
[0023]F:TAATACGACTCACTATAGGGCCGAAGTTTACATTCAAGCTATTATTTAC
[0024]R:TAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTG
[0025]RAA扩增片段序列：
[0026]GCCGAAGTTTACATTCAAGCTATTATTTACAGCTTTAAATGCTGTACCAAATTTCGCAATTAATTGTGATTCACTGTAAGCCATTTCGTCATCATAATCAATTTTTGCACTTACATTTGGATAAGCTTGAGCATATTTTTCATTCCATCTTTCCACTAATGTATTTACTGCGTTGTTAACGTTTGATTTAGTGGCATTTTTTACAACTATTTTATTGTCTTGATTAGTCATACCTGGCAAATCAATGCTGAGTGTTAATGAATCACGTTTTA。
[0027]用于CRISPR/Cas13a系统的特异性靶向单增李斯特菌hly基因的crRNA，序列为：
[0028]5’‑
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGUAAAUACAUUAGUGGAAAG
‑3’
，序列格式为：5
’‑
与CRISPR/Cas13a蛋白特异结合序列
‑
crRNA靶标结合序列
‑3’
，其中后半段序列GUAAAUACAUUAGUGGAAAG与靶标RNA序列互补。
[0029]一种用于检测李斯特菌的RAA
‑
CRISPR/Cas13a系统，包括单增李斯特菌hly基因靶标序列及RAA扩增引物对，和针对目标基因的靶标序列设计的向导RNA，即crRNA。
[0030]另外，本专利技术提供了CRISPR
‑
Cas13a系统用于检测李斯特菌的应用。
[0031]本专利技术包括RAA扩增引物对及特异性靶向单核细胞增生李斯特菌溶血素编码基因(hly基因)的crRNA。首先提取单核细胞增生李斯特菌基因组DNA，通过RAA扩增获得携带T7启动子的DNA片段，经T7 RNA聚合酶体外转录得到靶标RNA，当靶标RNA存在时，可激发Cas13a
‑
crRNA复合物对单链RNA的切割功能，剪切RNA荧光报告分子中的淬灭基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于快速检测单核细胞增生李斯特菌的联合检测方法，其特征在于：(1)利用携带T7启动子的扩增引物和RAA扩增体系对细菌样本DNA进行等温扩增，获得T7
‑
DNA目的片段；(2)针对李斯特菌hly基因的靶标设计向导RNA，即crRNA；(3)将商品化T7 RNA聚合酶、NTP、RAA产物、Cas13a蛋白、crRNA、荧光报告分子和李斯特菌体外转录的含靶标RNA片段混合进行等温孵育，用荧光检测仪进行信号收集并记录。其中，携带T7启动子的扩增引物为：上游引物F:TAATACGACTCACTATAGGGCCGAAGTTTACATTCAAGCTATTATTTAC；下游引物R:TAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTG；扩增片段为hly基因第258
‑
529位碱基，共272bp；目标基因为检测系统中特异性靶向李斯特菌溶血素编码基因的crRNA，序列为：5
’‑
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGUAAAUACAUUAGUGGAAAG
‑3’
。2.根据权利要求1所述的联合检测方法，其特征在于：步骤(1)所述RAA扩增体系包括重组酶、DNA聚合酶和单链DNA结合蛋白。3.根据权利要求1所述的联合检测方法，其特征在于：步骤(1)和(3)均为38℃环境孵育。4.根据权利要求1所述的联合检测方法，其特征在于：步骤(3)反应体系中的RAA产物T7
‑
DNA在...

【专利技术属性】
技术研发人员：方维焕，孙思琪，李肖梁，付豪，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：